把多肽从反相色谱柱上洗脱下来用的是含有有机相和离子对溶剂或缓冲液的水溶剂。有机相把多肽从疏水性表面溶解并洗脱来下，同时离子对试剂或缓冲液调节洗脱pH值，并与多肽相互作用以加强分离。洗脱采用的是逐渐提高色谱时有机相比例（溶剂梯度）的方法。当溶剂达到能引起脱附的浓度时，多肽就从色谱柱子上脱附并洗脱下来。
有机相的作用是把多肽分子从疏水性的吸附表层脱附下来，慢慢升高有机相的浓度（梯度），直到多肽脱附并洗脱下来。在前述文章中已说明，由于多肽疏水脚的关系，多肽类的分离多发生在柱头，与有机相的浓度（比例）有关，故其分离总是采用缓梯度进行。而对于其所使用的有机相，不同类型的有机相有不同的性质，会带来不同的选择性：
1、乙腈（ACN）乙腈（ACN）是最常用的有机调节剂，这是因为它：
■ 易挥发，容易从收集的组分中除去；
■ 粘度低，柱压小；
■ 短波几乎无紫外（UV）吸收；
■ 经长期使用证明，其在RP-HPLC多肽分离中比较可靠。
2、异丙醇（IPA）
异丙醇（IPA）常用于大分子蛋白质或非常疏水的蛋白质。异丙醇的主要缺点是粘度大。为了降低异丙醇的粘度而保持其疏水性，我们建议使用乙腈：异丙醇=50:50的混合液。在有些情况下，在乙腈中加1%-3%的异丙醇能增加蛋白质的回收率。
3、乙醇（EtOH）：
乙醇（EtOH）常用于过程规模纯化。乙醇是一种优良的RP-HPLC的溶剂，它价格低廉，被FDA等管理机构所熟悉。乙醇已用于洗脱疏水性的跨膜蛋白质，也用于纯化处理。
4、甲醇或其它有机溶剂：
甲醇或其它有机溶剂与常用的溶剂相比没有什么特别的优点，一般不用与多肽分离。
多肽分离通常首选梯度洗脱，哪怕是非常缓慢的梯度系统洗脱。等度洗脱往往产生较宽的峰。典型的溶剂梯度是每分钟有机相浓度增加的斜率为0.5-1%。像每分钟0.05-0.1%这样极低的梯度变化往往能获得最大的分离度。
图一：有机相变化率对分离的影响考察
如上图所示：减缓梯度变化的速率，能带来分离上的改善。
尽管我们的文献强调了减缓梯度所能带来的分离的改善，但是仍需注意，在某些时候，因扩散的原因，减缓梯度并不能达到预期的分离改善，此时便需进行综合评估，优化条件，以达到满意的分离度。
为了达到最佳重现性和平衡，要避免使用极限浓度的有机调节剂。一般建议，有机调节剂的起始浓度不要低于3-5%，起始浓度低的有机调节剂梯度会因为柱子表面很难“润湿”，而引起色谱柱平衡时间过长或没有重现性。另一方面，也建议有机调节剂的结束梯度不要超过95%。有机浓度过高会洗去全部有机相上的水，也会使柱平衡更加困难。
梯度斜率对肽选择性的影响：
由于有些肽和反相柱子表面发生作用的方式有微小的差异，所以溶剂梯度的斜率可能会影响肽的选择性，由此影响肽之间的分离度。
通过在不同的梯度时间，用不同的梯度斜率分离人生长激素的胰蛋白酶消化物，可以很好阐明这种影响。图二中是在三种不同的梯度斜率（时间），对人生长激素的胰蛋白酶消化物一些碎片的分离。随着斜率的降低，碎片9和10的表现和预期的一样，即分离度随着梯度斜率的降低（梯度时间增加）而提高。但是，碎片11和12表现不同。分离度随着梯度斜率的降低而减小，这表明改变梯度斜率时选择性发生了变化。如果要改进方法并考查该方法对每一肽对的影响，当温和地改变梯度斜率时，要对这种影响进行监控。
图二：不同梯度时间肽的分离
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