核酸 Tm 测试，尽在 Cary 3500 UV-Vis

安捷伦视界

2021.6.04

作者安捷伦

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紫外-可见分光光度计是化学实验室常用的分析仪器，在化学结构鉴定中发挥着重要作用。200-800 nm 的波长区域，相对应的能量为 670-155 kJ/mol，满足芳香性化合物或含共轭双键结构的化合物发生 π-π 电子跃迁，因此，此类化合物会显示紫外吸收光谱。

含芳香环和 / 或共轭双键结构单元的化合物可以说是无处不在，染料、食品添加剂、医药产品和大部分致癌物，以及生命活动中的重要物质基础 — 蛋白质和核酸，都可见其身影。利用紫外光谱的变化和有无特征吸收可作为此类化合物常用的鉴定方法。

在核酸研究领域，天然的功能核酸（例如，各种 miRNA、lncRNA、shRNA 等）和人工筛选的功能核酸（例如，脱氧核酶、核酶、适配体等）不断被发现或筛选出来，在基因功能研究、药物发现、生物传感器探针等领域的应用研究越来越多；尤其是核酸药物（反义核酸、小干扰 RNA 等）的陆续上市，使得核酸成为当前生命科学和药物研究的热点之一。而核酸的高级结构是其行使这些功能的物质基础，因此高级结构的稳定性是核酸应用中需要考虑的至关重要的因素。对于核酸这类较大的分子，在传统的四大谱学方法中，唯有紫外光谱是研究其结构变化的可行而简单的方法。

核酸结构随温度的变化是可逆的，且不会使核酸变性。在一定的溶液条件下，一个核酸序列依赖氢键和静电性作用在低温形成特定的高级结构，芳香性碱基发生堆积，产生减色效应，导致紫外吸收值降低。当温度升高时，氢键和碱基堆积等弱相互作用被逐渐破坏，紫外吸收值逐渐升高。因此，配备温度控制的紫外光谱仪非常适合测定核酸结构的稳定性。随温度的升高或者降低，当核酸的紫外吸收值达到最高值一半时，所对应的温度被定义为核酸的熔点，以 T_m 表示。T_m 的大小反映核酸结构的稳定性高低。T_m 值越大，核酸的高级结构越稳定。因此，控温型紫外光谱仪在核酸结构研究中能发挥独一无二的作用。

核酸的高级结构具有多样性，其结构随温度的变化有快有慢，带来的紫外吸收值变化有大有小。因此，要求仪器的温控部件具有很高的灵敏性，需要满足从 0.1 ºC/min 到 1ºC/min 的温度变化控制。安捷伦 Cary 3500 紫外可见分光光度计的控温模块，采用独特的半导体控温、空冷设计，升温速率可以从 0.1 ºC/min 到 40ºC/min，能够分辨核酸高级结构变化中的多种形态。与此同时，一体式的模块设计，可避免传统水控温装置繁杂的管路和工作噪声。

安捷伦 Cary 3500 UV-Vis 分光光度计

仪器配备的 Cary Workstation 软件操作系统，沿袭了安捷伦 Cary 系列紫外-可见分光光度计软件模块化设计的理念，且操作界面采用了最新的网页化设计，更符合年轻用户的上网习惯。当用户需要进行核酸的高级结构分析应用时，只需打开 Thermal 模块，将温度区间及升/降温速率设置到软件内，即可获得样品的热力学曲线。利用内置的 T_m算法，可直接读取样品的 T_m值数据。下图为采用 0.5℃ 的升温速率测试的核酸样品在 260nm 处的热力学曲线以及通过导数算法计算出的 T_m值曲线图。

左图为安捷伦 Cary 3500 UV-Vis 进行核酸样品采集的热力学数据，右图为计算的 Tm 图

Cary 3500 UV-Vis 控温模块还有一个设计亮点：可配置成 8 池 4 温区。每两个池位由一组独立的控温模块控制，可同步实现 4 组样品的独立采集，效率提升 4 倍。当考察核酸高级结构的多个影响因素，如金属离子的种类和浓度、pH 等条件时，8 池 4 温区附件可满足用户准确控温以及高效测定的要求，是进行核酸高级结构研究的理想选择。