【领读】突变 VS 疫苗，Spike 表面展示平台加速新冠疫苗设计

本文的研究始于 Spike 表面展示质粒构建。为了实现表面展示以及使用高通量 Golden Gate 克隆技术，研究者对质粒的构成以及构建过程做了优化（详细参考原文），其中 Golden Gate 构建体采用了高通量自动化管线组装，该管线包括 Echo 525 声学液体处理机，Tecan Fluent 和 QPix 420 微生物克隆筛选系统，在经过 PCR 等过程将构建好的质粒转化培养，接种在含有 LB- 琼脂+羧苄青霉素（100μg/ mL）的 Nunc OmniTrays（Thermo Fisher; 140156）上培养。

第二天对菌落进行筛选，并使用 QPix 420 进行挑选，仅选择白色菌落，避免使用绿色荧光菌落，该菌落仍包含 sfGFP 盒而不包含所需的刺突序列。

随后在 HEK293T 细胞表面表达 SARS-CoV-2 Spike 胞外域并验证其结构及构象。Spike 胞外域包括 6 个脯氨酸替换将同源三聚体复合物稳定在融合前状态，并伴随着具有全球优势的 D614G 突变（称为 6P-D614G）；同时 Spike 通过 N 端 Ig Kappa 分泌信号和 C 端 PDGFR-β 跨膜结构域定向到细胞膜；58 个氨基酸（aa）柔性接头包括一个三联 FLAG（3xFLAG）表位标签；一个 Strep II 标签（用于纯化）和一个 3C 蛋白酶切割位点（图 1 a）。免疫染色固定细胞在细胞膜上展示出 Spike（图 1 b 和图 2）。通过负染电子显微镜（nsEM）证实了天然的三聚体组装及预测的构象。

图 1

之后研究者通过流式细胞术评估了 SARS-CoV-2 Spike 变异体和 Spike 同源物的表达和抗原性。结果表明哺乳动物细胞表面突变的 SARS-CoV-2 Spike 表达与重组 Spike 突变异体的相对表达密切相关（图 1 d）。相关 β- 冠状病毒 SARS-CoV-1，MERS 和 HKU1 的 Spike 的相对表达也遵循其重组蛋白的相对稳定性（图 3 a-b）。

接下来，通过测试将 SARS-CoV-1Spike 融合前的稳定脯氨酸取代，来测试是否可以将 Spike 展示用于抗原设计（图 3 d-e）。Spike 表达提高了 5 倍，表明与亲本 SARS-CoV-1 构建体相比进一步稳定。研究者得出结论，Spike 展示可用于快速评估冠状病毒 Spike 变异体的结构表达，并用于设计下一代融合前稳定的疫苗靶标。

接下来测量了表面展示的 Spike 的 ACE2 结合亲和力。如预期的那样，SARS-CoV-1，SARS-CoV-2 和分离的 RBD 结合 ACE2，而 Spike（ΔRBD）并没有结合 ACE2。相对于 CoV-1 Spike，SARS-CoV-2 的亲和力更高，这与先前使用纯化蛋白进行的体外测量一致。MERS 和 HKU1 spike 分别识别人 DPP4 受体和 9-O- 乙酰化唾液酸，对 ACE2 没有亲和力。

最后通过表面展示测试了分别于 RBD-、NTD- 和 S1（quaternary）结合的 REGN10987、4A8 和 2-43 中和抗体，结果证明结构域特异性的中和抗体结合完整的 Spike，而仅 RBD 只结合 REGN10987。接下来研究者又测试了其他 7 种 NTD 结合中和抗体的定量结合亲和力，结果显示 Spike 展示是用于测量抗体和抗原结合亲和力的定量平台。（图 1 h）。因此，测定全长 Spike 胞外域（S-ECD）上的中和抗体结合将成为快速发现和表征抗体的有价值的工具。

SARS-CoV-2Spike NTD 在经血清转化和接种疫苗的患者中引起高亲和力中和抗体。但是，所有 Spike 蛋白突变中的 46％ 位于 NTD 中，比随机分布的高两倍（预期为 23％）（图 4 a）。这些临床 NTD 突变增加了免疫压力和随后逃逸的可能性。

为了阐明结合和中和的机制，研究者集中研究了十种中和的 NTD 定向抗体，其中六种的抗原决定簇通过 cryo-EM 定位。研究者克隆了包含所有五个 NTD 环和相邻残基的 72 个丙氨酸 Spike 突变异体（图 4 b），针对上述十种 NTD 中和抗体以及结合 RBD 的 ACE2 和 REGN10987 作为阴性对照测试了该丙氨酸文库（图 4 c）。

结果表明 4A8、CM17，CM25 和 1-68 对丙氨酸取代敏感，它们识别相同的表位。另外研究者推测 1-87 的 CDR-1 和 -3 受 NTD 表面单个丙氨酸取代的影响最小。抗体 5-7 和 4-19 对 N1 环（残基 14-26）和 N5 环中以及 N3 和 N4 环之间的区域更敏感。而且结果表明 N3 环主导 NTD 介导的 Spike 中和,相反，N2 和 N4 环中的突变与抗体结合无关紧要。Spike 展示通过提供高分辨率的抗原决定簇图和报告由于氨基酸取代而引起的亲和力变化，对结构研究和 Fab 竞争测定法进行了补充。

在丙氨酸扫描结果的指导下，研究者分析了 46 个非同义 NTD 突变异体对 Spike 表达和抗体逃逸的影响。所有 NTD 突变异体均保留了 ACE2 结合和 Spike 表达的野生型水平（图 5 a）。如丙氨酸扫描所强调的，在 Tyr145 上的取代强烈降低了 4A8 的结合，也减少了 CM17，CM25 和 1-68 的结合。其中 M153T 和 S254F，它们都展示出很强的从 CM30 逃脱的能力（图 5 b 和图 6）。

NTD 环 N3 和 N5 的缺失和插入也是逃避免疫的可能途径（图 5 d）。实验室进化的 SARS-CoV-2 病毒在 N5 [248aKTRNKSTSRRE248k]中插入了 11 个氨基酸，逃避了高滴度恢复期血清的感染。为了阐明逃逸机制，研究者针对上述的中和抗体组分析了这些变异体（图 5 e）。

结果表明，N3 和 N5 环之内或附近的插入缺失有效地消除了中和抗体结合，这可能是由于关键残基的缺失或 NTD 环的空间重构所致。N5 环中的插入也有效地逃避了中和抗体。随着免疫逃逸成为日益接种疫苗的世界中主要的进化因素，NTD  插入也可能变得更加普遍。接下来，研究者检查了 RBD 突变，结果强调了在完全糖基化的 Spike 三聚体的背景下表征中和抗体逃逸突变的重要性。

图 5

图 6

研究者量化了关注的变异体（VOCs）中的 Spike 表达。英国（B.1.1.7），南非（B.1.351），巴西（B.1.1.248）和加利福尼亚（B.1.427 / B.1.429），分别具有八个，九个，十个和三个 Spike 突变。相对于野生型（6P-D614G）Spike，谱系 B.1.1.7 的 Spike 表达增加了 39％，而 B.1.351，B.1.1.248 和 B.1.427 / B.1.429 则分别降低了 32％，47％ 和 62％（图 7 a）。所有 VOCs 都带有 D614G 取代基，可显著增强Spike表达（图1d）。在某些变异体中，K417N（B.1.351）和K417T（B.1.1.248）进一步积极补偿了 Spike 表达。

接下来研究者确定了 4 种 VOCs 对 ACE2 结合和中和抗体逃逸的综合作用（图 7 b-e）。研究结果表明有益于病毒适应性（免疫逃逸和 ACE2 结合）的 Spike 不稳定突变可以被其他稳定突变所补偿。ACE2 模拟物有望成为 SARS-CoV-2 抑制剂，但现代的 VOCs 尚未评估其功效。研究者测试了这些 VOCs 如何结合 LCB1，LCB1 是一种工程化的 α- 螺旋肽，可与 ACE2 竞争与 RBD17 的结合。

结果显示变异体 B.1.1.7 在> 1 nM LCB1 以上有效抑制了 ACE2 结合（图 7 m）。B.1.351 和 B.1.1.248 显示完全逃脱；B.1.427 / B.1.429 变异体显示出中等程度的逃逸。K417N / T，L452R，E484K 和 N501Y 点突变均在 LCB1-ACE2 接口附近，并且可能降低 LCB1 结合亲和力（图 7 l）。因此，未来基于肽的抑制剂疗法将需要一系列抑制剂来规避 VOCs。或者，必须不断优化这些肽以提高抗新兴病毒变异体的功效。

图 7

本文开发了 spike 展示技术，预计 Spike 展示可以适应各种冠状病毒家族的 Spike 和其他病毒抗原（图 1 e）。Spike 展示可以从细胞表面切出 Spike，以进行结构和生物物理表征；可补充用于高分辨率表位作图的结构功能研究；加快抗体 -Spike 相互作用的表征，同时对所有可能的氨基酸取代进行深度突变扫描将广泛用于表征 Spike 突变情况以及泛冠状病毒疫苗抗原的开发。从 Golden Gate 装配到表征的整个过程都可以在 5 天内完成，将加速疫苗设计并快速评估新兴病毒株中突变的影响。

针对某些 Spike 变异体现有的靶向 NTD 的中和抗体必须与靶向其他表位的中和抗体配对才能避免治疗上的逃避，另外未来的 ACE2 模拟疗法也将需要重新制定，以领先于当前和新的关注变异体。

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