某仿制药项目的有关物质液相分析方法开发

这是一个仿制药有关物质的方法开发，撰写此文以记录如何开发一个新的方法以取代原方法。

某药典中采用的方法是：

PhaseA：辛烷磺酸钠溶液（以辛烷磺酸钠2.6g，加水1000ml使溶解，加三乙胺3ml，摇匀，用磷酸调节pH值至2.5）。

Phase B：乙腈:甲醇=18:82(V/V)

色谱柱：C18

波长：280nm

梯度参数：表1

表1 原方法之梯度

从经验出发对以上已有方法来进行分析，发现原方法存在几处关键。药典方法本身使用了离子对试剂，同时又使用了梯度，这个方法的重现性可能存在一定的风险。药典方法使用了乙腈和甲醇的混合流动相作为强洗脱剂，预计其目的是提高某些杂质的分离的选择性。按照已有知识，磷酸三乙胺的酸性缓冲体系往往被用来增敏苯环异构体的选择性，预测其使用目的是解决有关物质的苯环位置异构的分离。本例计划从工艺部门的实际工艺过程能力和要求出发，力争去除离子对试剂，简化分析方法，提高专属性。

首先对目标物质进行疏水性的分析，利用ACD/pH Selector对API及有关物质的logD进行预测，得到下图所示的logD图，如图1。此次计划列入研究对象的共计14个物质，结构不便拿出。图中可见有较多的物质的logD曲线重叠，只能分辨出9-10条曲线，此与上文的分析相一致。其中有两个物质的logD值在酸性条件下在-2以下，预判在普通C18上可能会存在保留风险。可以理解为何药典中用了离子对试剂。从logD图中还能知道，在pH2-6的范围研究对象的疏水性基本不受pH的调动，对pH不敏感。

图1.研究对象logD叠合图（pH Selector出图）

第一轮筛选：pH峰型筛选

使用ACD Percepta对API的logD进行分析确认API是个强碱弱酸类的物质，图2，图3为logD和pKa数据。图2 logD的最大值在2左右，看来在碱性条件下，API的保留并无风险，酸性条件下logD的大小低于0，酸性条件保留会较差。

因此首先采用API工艺样品进行pH值的筛选，查看不同pH值对主峰峰型以及保留的影响。基于logD叠图，使用Symmetry C18色谱柱，选择pH2.5、pH5.0、pH7.0、pH7.5、pH8.0进行pH值筛选。由于pH2.5目标物可能保留不佳，因此pHA使用了离液剂来增大保留，选择使用高氯酸盐作为离液剂。

图2.API logD图（ACD Percepta出图）

图3.API pKa图（ACD Percepta出图）

从保留时间的角度出发，以表2中实验2-5的筛选结果来分析，目标物的酸性条件下的保留会较弱，中性以及碱性保留较好，此与logD的预测有所匹配。实验2的结果的保留时间为12分钟左右。从表中的拖尾因子参数可以看出，在添加了离液剂的体系下即pH=2.5时峰型最好。通常碱性化合物在中性到碱性条件下峰型趋向变得更好。本例中也有此种趋势，但是拖尾因子在pH7-8一直较高。反而是本例中使用了高氯酸盐离液剂的酸性筛选条件拖尾因子最低。

此外，API中含有苯环上邻位双羟基的子结构，猜想可能是邻位双羟基产生的分子内氢键可能导致主峰峰型不佳。于是考察不不同柱温对峰型的影响，实验结果发现温度升高有利于主峰峰型。

第二轮筛选：色谱柱选择性筛选

显然离液剂高氯酸钠足可以代替辛烷磺酸钠增大有关物质的保留，因此为了方法在工艺阶段的可用性和便利性，应采用高氯酸钠进行酸性体系和较高的柱温进行色谱柱筛选。在色谱柱筛选时，采用了API加杂质定位品的混标，以考察不同色谱柱的选择性。

表3.色谱柱筛选结果

典型谱图:

图4.Symmetry C18和Xtimate C18的选择性比较

对色谱柱筛选得到的色谱图进行分析，虽然主峰在Xtimate C18上的峰型稍逊于Symmetry C18，但Xtimate C18展现出更好的选择性，如图4，最后选用Xtimate C18进行方法优化。

筛选阶段主要考察的标准是主峰峰型及不同色谱柱体现的选择性，从上面筛选阶段的色谱图来看，仍然有较多的分离矛盾。因此针对筛选结果，进行基于数学模型的优化设计。

第一轮优化：梯度温度优化

考虑到分离对象较多，设计了梯度和温度2因素3*3的实验设计。利用ACD/LC-Simulator创建了梯度温度2D模型,如图5，并通过模型找到的方法，目标杂质达到的最小分离度为1.25，尚不能满足分离度的要求。

图5.梯度温度的两因素分离模型

第二轮优化：梯度温度混合有机相优化

考虑到药典方法中强洗脱有机相使用了是乙腈:甲醇=18:82(v/v)，相信其扮演了重要的选择性的角色。因此探索一下不同比例的混合有机相，加做乙腈:甲醇=18:82(v/v)和乙腈:甲醇=50:50(v/v)，比对目标物是否有选择性。实验结果如下图所示，不同混合有机相比体现出不同的选择性。

图6.混合有机相的选择性探索

根据图6所示，混合有机相体现出一定的选择性。因此设计包含梯度，混合流动相，温度3因素的DoE实验，并构建3D模型，如图7所示。

图7.梯度，混合流动相，温度3因素模型

通过对模型的分析，在三维空间最终找的简单单阶梯度方法。主峰峰型合格，关键Pair能达到要求而且运行时间较短，ACD/LC-Simulator预测谱图8a如下所示，预测关键Pair最小分离度为1.68.最终验证谱图如图8b所示，关键Pair最小分离度为1.70。

图8a.模型方法预测谱图

图8b.实际加标谱图

本例中，通过对目标物的研究，对参考方法的认知和吃透，我们开发了一个条件温和，专属性高分离能力强且条件温和的液相方法准备用于公司内部的工艺研发使用。后期在模型的基础上再加做耐用性验证实验以及其他必要的方法验证实验，此方法未来有潜力用作QC方法。以上方法的开发过程遵循知识优先，且先筛选后优化的原则，充分使用ACD的知识工具和建模工具，令方法开发过程本身的逻辑性提高，随机性降低，基本符合AQbD的理念，因此撰写出来，分享给ACD的用户。

感谢嘉诺康徐甜对此案例的分享。这个案例讲述了一个完整的方法开发流程，从药典提供的方法到制定合适的筛选策略，到遇到主峰峰型问题探索可能导致的原因，再到最后的优化阶段通过3D模型完美的解决了分离问题。在方法筛选阶段主要以主峰峰型和色谱柱的选择性作为评判标准，为方法优化寻找到一个好的起点。而在方法优化阶段借助ACD/LC-Simulator构建的多因模型探究多因素相互之间的关系，而从最终找耐用性范围宽的方法。ICHQ14也要求分析工作者在进行方法开发时采用多因素DoE实验，探究不同因素之间的相互影响关系。而ACD/AutoChrom正是基于QbD理念的辅助分析方法开发的软件，可以帮助分析工作者极大的提供方法开发的效率。

——ACD/Labs 李丹