某口服固体制剂有关物质方法开发

ACDLabs CN

2021.8.31

作者 ACD

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背景介绍

这是一个仿制药有关物质的方法开发案例，由于药典方法或文献方法无法满足自研产品的有关物质检测。本文通过以一个文献方法为基础，重新设置梯度&流动相pH开发方法的过程，阐述本方法开发的思路及遇到的问题。

文献中该品种有关物质检测方法：

色谱柱：辛烷基键合硅胶色谱柱

柱温：50℃

流速：1.2mL/min

梯度：

对于此方法分析初步评价：

首先，有关物质方法采用三相进行梯度实验的比较少见，对于仪器有要求，二元泵仪器无法完成该检测，对泵的精准性要求也比较高；其次，使用该方法对自研产品进行有关物质检测时发现有部分杂质分离情况不好。故希望通过一个梯度与pH的正交试验，对该检测方法进行一个全面的考察，顺便研究耐用性。

实验设计和数学建模研究

流动相A：50mM KH₂PO₄溶液（调pH5.0、pH6.0、pH7.0）

流动相B：甲醇-乙腈（2:1, v/v%）（ps：原方法甲醇-乙腈体积比变换范围为（1.5:1~3:1），故折中考虑选择2:1，如在该比例条件下没有好的结果，可能后期会进行甲醇-乙腈比例的考察）

梯度与pH正交试验设计表，表1：

表1 梯度和pH的正交设计

采用配备了多柱切换系统及9路溶剂通道系统的Waters ARC UHPLC进行实验，每个条件平衡后进样已知杂质混合溶液及加入已知杂质的供试品溶液各1针（由于“过分自信”没有进行各条件杂质单独定位，只进样了杂质混合溶液定位，为后续建模不准埋下伏笔）。

实验后各峰RT（min）表，如表2：

表2 有关物质保留时间

通过ACD软件构建梯度&pH两因素模型，模型如图1：

图1 梯度和pH的模型图，提示pH5.6范围下有全局最优

根据模型选择了pH5.6（越偏红色区域说明各峰最小分离度越大）,梯度为表3：

表3 最优结果下的较短时间的梯度

将该条件进行验证下得到图谱，图2：

图2 pH5.6下的验证实验结果

预测与真实试验各杂质峰保留时间对比表，表4：

表4 模型实测预测表

其他杂质均与预测相符，只有葡萄糖加和物与杂质IV与预测不相符。在该条件下单独定位了葡萄糖加和物与杂质IV，确定是共流出了。对于这个结果暂未进行深究，因为在该条件下我们同时进行了空白辅料溶液，发现未知杂质1与未知杂质2均是辅料引入峰，这两个峰未分离不影响杂质检测，故在模型中去除了这两个峰，再次模拟得到如下模型图，图3：

图3 去除辅料峰影响后的有关物质模型图

模型提示pH6.0为最佳,梯度为表5

表5 pH 6.0下执行的梯度

在该条件下得到图谱，图4：

图4 pH6.0下梯度表的实际数据图

各杂质出峰与预测十分接近，但未参与建模的杂质对杂质I及葡萄糖加和物检测有干扰。当前方法虽然时间较短，但是主峰后有未知杂质干扰，因此不是符合条件的方法。

回顾实验，发现pH6.0条件下，梯度：0~35min，流动相B：15~40%所的色谱图各杂质分离状况较好，故在该梯度方法基础上最后增加一小段等度，将强保留杂质冲出。最终得到如下色谱，图5：

图5 pH6.0下优化的结果

各杂质分离良好，从模型上看，耐用性范围较宽，可作为最终检验方法进行预验证。

Waters UPLC再加上使用ACD软件的梯度&pH建模进行的方法优化，进行方法的设计和模型验证的情况下，前后进样在18针左右，耗时2个工作日（如果紧张点一天就完成实验），极大的提高的方法开发及方法优化的效率，而且在进行建模后能够对整个考察参数范围内各杂质RT运动轨迹及分离状况了然于胸，保证开发出的方法耐用性更稳健。

问题讨论

目前已经有了可用的方法，倒回来再研究pH5.6下的模型预测和实测失真的问题，在首次进行建模后验证时发现的pH5.6下葡萄糖加和物与杂质IV预测不准的问题。将此案例与ACD中国区经理的阎作伟沟通，被评价为“非常有意思的结果”，因为出现了主成分和加合物杂质在pH5和pH7两次靠近的现象。阎作伟经理表示这种情况可能发生，但实际上还是很少见。他提醒是否在建模时杂质定错了位。遂与实验实施人员复盘了所有数据，结果发现，杂质定位判断的确出错了，如图6a和图6b

图6a 错误的杂质定位判断

图6b 正确的杂质定位判断

图7 三个杂质的LogD叠加曲线

由于主成分与杂质IV在pH5~7之间LogD变化比较大，保留差异有增大的趋势，而葡萄糖加和物在pH5~7之间LogD基本变化较小。应该通过LogD叠加曲线的曲线间相互关系和物质的保留情况进行印证，实在难以确认就需要老老实实的在每个条件下进行单独的峰定位。杂质IV穿越葡萄糖加和物在logD图上没有提示，也许与本例用的是C8柱有关。

纠正了这个小（致）小（命）的错误重新建模，在pH5.6条件下，确实葡萄糖加和物与杂质IV分不开，如图8。

图8 定位修正后的模型能够准确预测出pH5.6的共流出

说明软件模型预测还是非常准确的，错误的定位判断导致了错误的模型结果。

写在最后的话

有位中国科学家说过“科学是严谨的，是容不得半点马虎的。”一个小小的判断错误导致进入了错误的空间，导致模型部分失效。此次是在错误的模型上，得到的一个好的结果，有赖于pH6.0 下的三个较好的分离结果。但找到好结果是源于好运气，假设pH6.0下并没有良好的分离的话，这个方向感就很难把握了。判断不明就需要增加实验的数量，把空间研究的更加透彻。

感谢天地恒一的案例，给读者带来了一个重要的提示。Peak Matching 一直是进行保留时间数学建模的难点之一。不论用自动化还是用手动Peak Matching都可以借助DAD，MS的结果做辅助。如果只是单波长下用色谱峰的形态进行Peak Matching，的确很考验眼力，如果是混标情况下，最好把加标的浓度配的不一样，这样也有利于提高辨识度。

by 阎作伟