通用的液相分析方法开发策略

摘要:本文提出了一种用于检测原料药、工艺杂质和降解产物的液相分析方法的开发策略。通过评估色谱柱类型/流动相种类组成的设计空间来保证目标方法的选择性：有意选择参数差异大的色谱柱，确保选择性差异；选择兼容MS检测器的缓冲盐溶液（提供相对较宽的pH范围），搭配不同的溶剂种类，并设置不同的线性梯度。采用LC-DAD-MS联用的液相色谱仪检测样品时，全过程使用ACD/Labs的AutoChrom在线控制仪器的版本实现数据采集和处理的自动化。

制药企业一直在致力于提高药学研究的效率，而现实的限速步骤在于分析方法开发的周期以及分析方法的适用性。目前分析科学家通过一些标准化的开发流程，快速识别诸如固定相、流动相和梯度程序等色谱方法关键参数，再根据实验设计（DOE）思想设计实验，通过对实验数据建模进行方法优化，从而建立最终的方法条件[1]。另外，UPLC色谱仪以及UPLC色谱柱的应用，进一步缩短了分析方法开发的周期，也降低了后续的检测成本[2]。此外，分析方法开发工具软件已经整合了高效液相色谱方法筛选和优化过程的自动化部分[3]。

本文建立在已有工作[4]的基础上，根据不同文献[5-6]描述的色谱柱参数的差异，选择不同填料的色谱柱（需要耐受酸、碱条件的流动相），分别为Waters提供的X-BridgePhenyl、X-BridgeC18柱和Agilent提供的ZorbaxSB-C8和BonusRP柱。基于缩短分析方法运行时间和色谱柱要具有足够的上样量的需求，选择适用于UPLC的色谱柱，规格均为4.6×75mm，Waters和Agilent色谱柱填料粒径分别为2.5μm和1.8μm。色谱柱选择性参数见表1。

流动相的水相选择能兼容MS检测器的缓冲盐及改性剂；有机相选择不同类型的溶剂（甲醇、乙腈）；以15min的梯度对色谱柱与不同流动相的组合进行筛选。根据筛选实验的结果，选择表现出最佳性能的条件，确定最适合进一步开发的色谱柱与流动相的组合，同时确认对分离结果有影响最大的实验条件；并以此进行第二阶段的DOE实验，优化分离条件，确认分析方法的操作空间。

整个过程以ACD/Labs的AutoChromOnline版本软件为基础，以图1所示的流程图为策略。AutoChrom提供了包括仪器控制，方法编辑、序列运行、不同检测器所得数据的处理与整合、色谱数据建模及预测的全流程自动化的工作方案，同时允许用户随时访问项目数据的单一用户界面。 

2.1 定义分析方法开发目标

适用于定量检测有关物质的色谱分析方法，色谱图中的色谱峰应对称，且有适宜的保留因子（0.5≤k≤20），同时色谱峰的分布应尽可能均匀，运行时间也应合适。具体要求如表2所示。

“pre-commercial”早期阶段方法开发的目标是定义杂质谱,可以用来定量描述活性药物成分或药物产品批次，并验证它们是否适合做毒理学或临床Ⅰ-Ⅱ阶段的研究。主要目标是从主要成分中分离出潜在的合成杂质和降解产物。在这个开发阶段，附加的质量属性是次要的。标记为“商业化生产阶段”的目标值更高要求并反映杂质方法的用于量化活性药物成分或药物产品中的特定杂质。满足这些标准的洗脱条件对于杂质方法的定义至关重要，以支持主要稳定性研究或用于关键临床研究批次的放行。下面的两个示例说明了设计标准的使用。

2.2 筛选实验方案

上述目标的实现，需要借助适宜的仪器、耗材与软件配合。在本案例中，实验采用Agilent1200SL系列液相色谱系统进行，该系统配有二元泵(滞留体积=1ml)、真空脱气机、自动进样器、柱温箱和溶剂切换阀、二极管阵列检测器(DAD)、多模源的四极杆质谱检测器(MSD)和ChemStation软件(AgilentTechnologies, Palo Alto,CA)。仪器控制、检测器信号处理、峰值跟踪、数据分析/可视化和建模均使用ACD/AutoChromfor ChemStation软件(ACD/Labs,Toronto, Canada)完成。具体组合见表3。               

所有实验数据通过ACD/AutoChrom实现自动化控制执行和数据收集。分析科学家通过使用ACD/AutoChrom中的LC-UV峰提取工具对DAD信号进行处理：从DAD信号中提取组分光谱图和峰纯度数据，基于光谱相似度和峰值大小，对DAD信号中检测到的成分进行跨信号匹配；并将保留时间，峰宽，不对称因子，等色谱峰信息汇总在一个表格中；同时使用ACD/AutoChrom中的IntelliXtract工具对MSD信号进行处理。离子峰基于保留时间汇总，单个组分由预期的12C/13C比值、加合物、多聚物、同位素和中性损失来定义；最后基于光谱相似度，在不同的筛选实验中对MSD信号中检测到的成分进行匹配。最终结果以表格形式体现。

药品研发的杂质研究主要涉及两个关键领域：IND阶段的毒理研究及商业化阶段的特定杂质研究。两者各有侧重又相互关联，尤其在有关物质的色谱方法开发。IND阶段有关物质研究的目标，是建立合适的分析方法，检测临床前批次原料药的潜在工艺杂质、降解杂质，明确杂质谱，确认原料药能否用于毒理实验，为后续的I期和II期临床实验提供安全性依据。但在NDA阶段，需要分析方法能定量检测制剂中的有关物质含量（尤其是API与辅料及其杂质产生的有关物质），对分析方法的灵敏度、准确性均有更高的要求。

3.1 IND阶段的有关物质方法筛选

本例中，API是由多步合成制备的不饱和羧酸。用于有关物质分析方法开发的溶液包括：

A：用API及其中间体（潜在工艺杂质）配制的混合溶液；

B：用磷酸盐缓冲液pH10和0.1N氢氧化钠溶液制备水解产物；

C：以0.3%过氧化氢和自由基引发剂2,4-二甲基戊腈溶液制备氧化降解产物。

表4描述了本例在IND阶段的杂质来源分析。采用表3所示的HPLC筛选实验条件对这五种样品溶液进行评价。

使用ACD/AutoChrom软件中的工具处理来自每个筛选实验的MSD和DAD信号，产生包含5个待测样品溶液中各成分的色谱图，如图2所示。每个筛选实验的结果与表2的方法开发目标进行了对比，确认最适宜的色谱柱和流动相组合(见表5)。其中BonusRP柱+0.1%甲酸水溶液+甲醇/乙腈，X-BridgeC18柱+0.1%甲酸水溶液+乙腈的组合，可以从主峰中分离所有组分；其中BonusRP柱+0.1%甲酸水溶液+甲醇的组合效果最佳。

3.2 Commercial商业化阶段的案例

进行了HPLC筛选和优化工作，以确定一种新药的杂质方法条件。该新药的活性药物组分为去甲肾上腺素再摄取抑制剂，制剂为固体口服片剂。通过稳定性和原辅料相容性试验，确定前期的强制降解实验模型能准确预测药品的稳定性杂质。以0.1N盐酸/甲醇(1:1v:v)配制成含一定量的API及其潜在制剂杂质的混合定位溶液。通过溶解在40℃/70%相对湿度下放置6个月的片剂来制备第二个制剂供试品溶液。经过毒理研究及稳定性预实验，结合杂质谱风险评估，确认了需要定入上市后制剂质量标准的有关物质种类（见表6），以表6的杂质为基础，采用表1所示的策略设计筛选试验条件，优化有关物质分析方法。

使用ACD/AutoChrom处理工具，从每个筛选实验的MSD和DAD信号获得了图3所示的色谱图，其中包含在两个制剂供试品溶液中检测到的相关成分。表7总结了用于确定最适合分析这些分析物的固定相和流动相组合的每个设计标准的结果。XBridgeC18和苯基柱与0.1%的氢氧化铵和乙腈被认为是较优的选择。

（实验条件见表1)

使用不同的梯度时间与柱温进行DOE实验，实验条件如表8所示。

（梯度VS柱温）

结果表明在较低的柱温下进行优化，可以提高早期被洗脱组分的保留因子（k），同时得到的各组分的保留值与溶剂强度符合lnk=a+bB，其中B与有机相比例相关，每个组分的洗脱模型被用来模拟不同梯度洗脱程序函数的分离。从模型中选择符合表1设计标准的色谱条件，并通过试验予以确认。最佳分离结果见图4，对应的色谱条件见图9。

3.3总结

表3所示的色谱方法设计筛选策略已被用于19个开发项目，包括Pre-Commercial阶段和Commercial商业化阶段的样品，这些项目涵盖的各种分析物具有不同的复杂性，理化性质见表10。满足拖尾因子标准的固定相/流动相组合包括：高pH流动相时使用C18柱和苯基柱，低pH流动相时使用BonusRP柱，而C8或BonusRP柱，在使用低pH/乙腈或含甲醇的流动相时，能提供的选择性更多。这组项目的平均总体成功率为0.28，汇总结果见图5。

表10：不同化合物性质汇总

图5筛选成功率(虚线表示不对称因子和选择性交集)

本文采用的有关物质分析方法开发策略是一条合理的途径，这个过程提供了一个可通用的原料药和制剂有关物质分析方法的起点。工作流程根据开发阶段不同略有差异，以匹配项目的特定需求。而合理使用合适的代表性样品配合质谱检测器和二极管阵列检测器，可以大大缩短超过80%的实验周期，节约实验成本。

色谱柱和流动相种类（包括宽范围pH值、有机相种类），需结合被分析化合物的性质进行充分考察，再针对连续变量（包括梯度、柱温、pH值（窄范围））进行DOE实验，建立模型，在模型中寻找最优结果，并以实验确认；必要时开展耐用性研究，确定适用的最终方法条件，流程图见图6^[7]。 

图6：分析方法开发流程图

该策略是通过ACD/AutoChromfor ChemStation软件与Agilent1200SL系列液相色谱系统、ChemStation软件共同实现的。ACDAutoChrom提供了完整的仪器控制，并根据筛选及优化实验的参数自动编辑方法和序列，自动信号处理，并整合不同检测器的数据，并根据数据建模。整个过程实现自动化，极大地节省分析方法开发时间。

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[3]G. Xue, A.D. Bendick, R. Chen, S.S. Sekulic, Automated peak trackingfor comprehensive impurity profiling in orthogonal liquidchromatographic separation using mass spectrometric detection, J.Chromatogr. A 1050 (2004) 159–171.

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