随着越来越多的生物制品参与治疗疾病，对这一类的生物制品的质量控制也日益严格。生产该类生物制品的过程中的细胞培养阶段，由于DNA具有稳定性，在细胞培养过程中宿主细胞残留的DNA中可能存在感染风险，甚至存在潜在的致癌性，免疫原性以及其他毒性。为了保证生物制品的安全性，各监管机构（WHO，FDA，NMPA等）对参与治疗疾病的生物制品中的残留DNA制定了严格的标准。
关于外源性DNA残留检测方法，在《中国药典2020》中列出了三种方法，分别是DNA探针杂交法、荧光染色法，以及定量PCR法。相比于DNA探针杂交法和荧光染色法，定量PCR法具有更高的灵敏度，精确性以及重复性，在本篇推送中，也会以定量PCR法为背景，与各位探讨在各个实验步骤中的注意事项以便做好DNA残留检测。
DNA残留荧光定量法总结为以下实验流程
实验流程看似简单，其中却有很多需要注意的地方：
1. 梯度稀释
根据2020中国药典在DNA残留检测实验中，需要至少5个连续标准品溶液浓度建立标准曲线，对宿主DNA和载体拷贝数进行绝对定量检测，因此，标准曲线的建立在此实验中也起着重要的作用。为了建立一个可信的标准曲线，在操作上需要注意以下几点：
用来做稀释的耗材建议使用0.5mL以上离心管，容量太小的耗材会导致溶液混合不均匀。
为了做出更好的线性，进行倍数稀释的时候要吸取较大体积标准品溶液（避免用1μL标准品+9μL稀释液这样的小体积体系进行稀释，10倍稀释可参考下图）。
每进行一步稀释都要进行充分的混匀，在点样前也要进行混匀。
为了提高准确性，每个浓度建议做3个复孔。
2. qPCR反应体系的配制
为了得到可信的结果，在qPCR反应体系的配制过程中也有需要注意的几点：：
qPCR的整个操作要低温环境进行，防止模板的降解，试剂避免反复冻融。
配制反应体系前试剂要充分混匀，除了模板外的反应体系要统一配制，然后再分配至qPCR管中，配制的时候考虑到操作或耗材带来的损耗需要多配若干个反应所需体系。
添加模板的时候注意枪头要排尽，不求快，平行加样。加样后要进行离心，将液体集中在管底，离心后注意观察反应体系液面是否平整，气泡是否排尽。
每个样品建议做3个复孔，每次除了样品以外还要加阳性对照和阴性对照。
3.qPCR分析
DNA残留检测对于荧光定量PCR仪的性能也有着一定的要求，需要高灵敏度可以检测出低拷贝样品的仪器。根据2020中国药典对DNA残留的检测指标中提出标准曲线R2≥0.98，斜率在-3.1到-3.8范围内，每组加标样品回收率在50%-150%之间，RSD≤30%：
耶拿的qTOWER3系列荧光定量PCR仪则可以满足DNA残留检测的需求：
下图展现了某国产CHO残留DNA检测试剂盒和Human残留DNA检测试剂盒在耶拿荧光定量PCR仪上做出的标准曲线结果：
图1 某国产品牌CHO残留DNA检测试剂盒在耶拿荧光定量PCR上做出的标准品梯度稀释结果（浓度分别为300 pg/µl，30 pg/µl，3 pg/µl，300 fg/µl，30 fg/µl，3 fg/µl）
图2 某国产品牌Human残留DNA检测试剂盒在耶拿荧光定量PCR上做出的标准品梯度稀释结果（浓度分别为300 pg/µl，30 pg/µl，3 pg/µl，300 fg/µl，30 fg/µl）
首页
