mRNA药物的关键质量属性分析

丹纳赫生命科学

2021.12.10

丹纳赫生命科学

mRNA药物是通过将编码抗原蛋白的mRNA接种到人体，利用人体细胞内的遗传物质进行表达合成抗原蛋白，通过抗原蛋白诱导和激活机体的免疫系统产生免疫反应，从而达到预防和治疗疾病的目的。由于其具有较低的感染和突变风险，能够同时诱导产生体液免疫和细胞免疫，免疫效能好，研发和生产周期短，容易实现量产等特点，目前被广泛用于传染性疾病、肿瘤及罕见病药物的研发。

mRNA疫苗的作用机制

（图片来源：NATURE REVIEWS | Drug Discovery）

mRNA药物在研发过程中，其稳定性和药物递送是需要面临的主要挑战。裸露的mRNA很容易受到体内RNA切割酶的攻击，mRNA也需要被高效地递送至细胞内从而进行翻译，发挥功能。因此，mRNA药物的关键技术为RNA的修饰与递送。

mRNA药物前期的研发工作主要集中在修饰 mRNA 的结构元件上，特别是5’帽区，5’UTR 和 3’UTR，编码区和Poly A 尾，修饰此类结构能有效改善 mRNA 在细胞内的稳定性和翻译效率。除此之外，对mRNA的结构进行表征分析，也是保证 mRNA 安全性和有效性的关键。

mRNA药物的结构

（图片来源：NATURE REVIEWS | Drug Discovery）

加帽率及Poly A 尾检测

在mRNA的结构表征上，丹纳赫生命科学拥有使用SCIEX高分辨质谱及毛细管电泳进行检测的方案。由于mRNA全长较长、分子量较大，所以在进行加帽率及Poly A 尾检测时，需要通过酶切的方式获得5’端的加帽短链及3’端的Poly A尾短链，然后分别进行毛细管电泳及质谱的检测。

mRNA加帽检测前处理

PA 800 Plus毛细管电泳制药分析系统可以分离获得加帽和不加帽样本的分离峰，目前经过优化，基本可以得到达基线分离，从而可以获得准确的加帽定量检测结果。对于100nt以内的单链核酸，PA 800 Plus可以分辨相差1nt的产物，从而对Poly A 尾进行检测。

PA 800 Plus毛细管电泳制药分析系统

对mRNA样本进行加帽率检测

PA 800 Plus分离pd(A) 40-60 Test Mix

采用SCIEX的高分辨质谱ZenoTOF™ 7600系统进行检测，根据精确分子量，不但能检测加帽和不加帽的样品，还能区分不同的Cap种类。同时质谱还能进行Poly A的长度分布表征及相对定量。由于核酸表征分析需要加入离子对试剂，这对质谱的抗污染能力提出了很高的要求。

高分辨质谱对mRNA样本进行加帽率检测

mRNA纯度及完整性分析

mRNA在制备、加工、配方和长期储存过程中可能会发生降解，因此通过对mRNA的纯度及完整性分析，对于产品质量保证和优化制造工艺至关重要。使用PA 800 Plus匹配LIF检测器可有效的依据mRNA片段大小来进行高分辨率的分离和高灵敏度的检测，该方法适用的mRNA范围较广，可进行0.2 kb-10.0 kb范围内的分析。

PA 800 Plus对mRNA长度完整性进行检测

合适的mRNA递送载体可实现对mRNA的高效包载，并在体内实现良好的表达效果。基于脂类或类脂化合物的载体是目前mRNA疫苗最常用的非病毒类载体。各种合成的和天然衍生的脂质已经被用来形成脂质体或脂质纳米颗粒（LNP），两者都被报道可以有效地递送基于mRNA的疫苗。

无论是脂质体或是脂质纳米颗粒包裹mRNA后的颗粒大小、粒径分布等都是影响递送效率的最主要的参数，丹纳赫生命科学拥有对载药脂质体进行不同维度检测的方案。

载药颗粒形态学观察

采用冷冻透射电镜进行载药脂质体的检测可以直观地观察脂质体的分布形态、颗粒大小和颗粒完整度，并且冷冻处理载药脂质体是在生理状态下对载药脂质体进行冷冻保存，不会对脂质体造成破坏，所获得的结果更加真实、清晰、准确。徕卡显微系统拥有全套的冷冻制样设备，包括对电镜载网的喷镀连续碳膜和辉光放电处理的EM ACE600，以及能够实现对样品安全冷冻的投入冷冻仪EM GP2，可以便捷地完成高质量的载药脂质体的冷冻前处理。

载药脂质体冷冻透射电镜图

Leica 载药脂质体冷冻前处理技术路线

载药脂质体包封率检测

另外，还可以采用分析型超速离心机对载药脂质体的颗粒大小分布进行检测，并计算游离与胶囊化药物的比例，为脂质体或是脂质纳米颗粒与mRNA药物的混合比例提供指导。采用分析型超速离心机进行载药脂质体检测的优点是：使载药脂质体保持天然状态，没有破坏性，并且检测完后可回收。

贝克曼库尔特分析型超速离心机（AUC）

对载药脂质体进行检测

载药脂质体粒度分布检测

粒度分布是指在一定的粒径检测范围内，对脂质体颗粒的大小进行分析，得到粒径分布图和相应的粒径分析结果（包括中位粒径D50，平均粒径Mean Diameter），以此控制生产的脂质体颗粒大小，以及用于生产质控，保证批次间的一致性。因为粒度分布可影响纳米载体体内分布从而影响被动靶向，所以是检测载药脂质体的重要指标。贝克曼库尔特的LS 13320 XR 激光粒度分析仪采用先进的偏振光强度差散射（PIDS）技术与激光衍射相结合，可对纳米级别的载药脂质体粒度分布进行精确检测。

LS 13320 XR 激光粒度分析仪对脂质体进行粒度分布检测

细胞外囊泡的检测

体液中的细胞外囊泡（EV）是由多种细胞分泌的携带有核酸、蛋白质和脂质等物质的一种纳米囊泡，在体内可发挥细胞通讯和物质传递的作用。因其具有良好的生物相容性、高生物渗透性和低免疫原性、低毒性等优点，被越来越多地用于mRNA药物的递送系统的研究。

流式细胞仪可以对EVs和其他生物颗粒（包括病毒和细菌）进行定量和多参数表征。但实际上，最灵敏的传统流式细胞仪已被认为无法检测到直径小于300纳米的EVs。由于微泡大小的范围实际上延伸至150 nm，而外泌体的直径在30–150 nm之间，因此这导致了一个共同的认知，即流式细胞仪只能检测到EVs的冰山一角。

贝克曼库尔特的CytoFLEX系列流式细胞仪是一种基于半导体集成电路化的流式细胞仪，将硅雪崩光电二极管（APD）与波分复用（WDM）结合，优化的流通池设计和二极管激光器配对使信号强度远大于传统流式细胞仪，而噪声远远小于传统流式细胞仪。另外，CytoFLEX上的紫色SSC（VSSC，405 nm）充分提高了小颗粒检测的灵敏度。