抗体表征理化属性分析

抗体药物是近些年来医药行业非常热门的赛道，先从单抗开始，在又相继开发了抗体偶联药物、多特异性抗体药物、纳米抗体等多种新兴技术。我们来看看抗体药物表征之理化属性分析。

抗体药物结构

抗体药物结构表征主要包括以下参数：

1)完整分子量

2)轻链分子量化学

3)重链分子量

4)氨基酸序列

5)二硫键

6)自由巯基

7)糖基化位点

8)N-端测序

9)翻译后修饰

10)二、三级结构表征

在前9项一级结构表征中，LC/MS是最主要和最基础的表征方法，我们基泰推荐THERMO高分辨质谱配合液相来做结构分析。高分辨质谱通过高分辨、精确质量数测量和多级碎片解析，完成复杂体系成份鉴定和表征，特别适合抗体表征分析。

抗体结构表征的目的，除了全面表征抗体药物质量，另外一个核心目标是寻找可能影响抗体药物疗效的关键氨基酸残基、关键氨基酸的翻译后修饰，进行相关工艺改造和确认，避免在工艺开发后期以及临床阶段，产生不良影响，主要包括：脱酰胺，异构化，Met和Trp氧化，未配对的半胱氨酸等。

1.1 脱酰胺

天冬酰胺（Asn），尤其是CDR区的Asn残基脱酰胺，是单克隆抗体药物最常遇到的降解途径之一。当Asn后面是小的且活跃的甘氨酸（Gly）残基（NG基序）时，容易发生脱酰胺，并且如果发生在CDR区，会导致对抗原结合亲和力降低，抗体效力丧失。因而在抗体测序和生物信息学评估时，需要关注CDR区的Asn-Gly残基，并在强制降解阶段对其进行评估。

此外在IgG的Fc段“ PENNY”环肽中，也包含脱酰胺易感位点，但是因为通常不会对抗体药物结合抗原带来负面影响，一般不做重点关注。

1.2 氨基酸氧化

蛋氨酸（Met）和色氨酸（Trp）残基容易发生氧化。其中重链CDR2中的蛋氨酸以及Fc区中的蛋氨酸氧化并不会影响抗原结合。但是当氧化水平较高，或者发生在抗原结合的关键CDR区域，会降低抗原结合能力，降低抗体药物的有效性。

靠近CH2-CH3区域的蛋氨酸残基易发生氧化，导致热稳定性下降，聚集增加，补体依赖性细胞毒性（CDC）下降，与FcRn的结合亲和力下降以及体内半衰期缩短。

CDR中Trp残基的氧化，可能导致有效性降低，热稳定性降低和聚集倾向增加。

总体而言，生物信息学分析和一级序列测定时，应重点关注CDR区Met和Trp的氧化，并确定它们的敏感性，必要时在工艺阶段采取适度控制策略。

1.3 Asp异构化

Asp异构化是单克隆抗体药物的另一种降解途径。CDR区的Asp残基，如果后面是Gly残基，His或Ser时，通常易于异构化。CDR区发生异构化，可能导致抗原结合亲和力降低。当pH值在5左右时，有利于Asp异构化，因此抗体药物的制剂配方开发时，需要注意其pH值尽可能避开5。

1.4 糖基化位点

IgG CH2 Asn-297连接的N糖为核心7糖结构，四个N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和三个甘露糖(Mannose)残基。根据抗体的功能需要，会对抗体的糖型进行改造，以获取相应的功能特性，以及延长或缩短抗体半衰期等。因而糖基位点检测分析贯穿于抗体药物工艺的整个过程，也是质量放行的关键质量属性。

抗体糖工程改造主要有岩藻糖基化，乙酰葡糖胺化，半乳糖基化，唾液酸化四种。

通过核心岩藻糖基转移酶(Fut8)催化N-聚糖GlcNAc核心岩藻糖基化；通过乙酰葡糖胺基转移酶3(GNT3)在分支角Mannose上添加乙酰葡糖胺（GlcNAc）；通过β-1,4-半乳糖转移酶1(b4GALT1)在七糖末端的两个GlcNAc添加半乳糖，使其半乳糖化。这三种策略是改变和1型FcγR的结合。在核心岩藻糖基化以及半乳糖基化的基础上，在α2,6-唾液酸转移酶（ST6GAL1)，可以增加抗体的唾液酸化，唾液酸化则可以增加和2型FcγR的结合。

糖异质性分析，通常使用LC/MS对于糖型进行鉴定，使用HILIC-FLD进行糖型定量分析，使用硼酸亲和色谱进行糖化检测。

1.5 未配对的半胱氨酸（Cys）残基

未配对的半胱氨酸会增加抗体的异质性，并可能对化学和热稳定、生物功能、聚体形成，抗原结合效力和蛋白折叠产生重大影响。单克隆抗体在CDR区可能具有未配对的半胱氨酸（Cys）残基，不过比较少见。未配对的Cys很容易地在细胞培养基中被游离的半胱氨酸修饰，会降低抗原结合亲和力。因此，未配对的半胱氨酸应视为质量属性进行常规监测和表征，以确保结构完整性和产品质量。

变异体分析

重组抗体在培养工艺、纯化、制剂等阶段都容易引入抗体大小变异体和电荷变异体。抗体大小变异体和电荷变异体是抗体鉴别和一致性评价的重要指标。

大小变异体检测常用方法包括分子量排阻色谱，CE-SDS（2015版药典收录，2020版做了修订）。

抗体药物的电荷变化反映了各种蛋白质翻译后修饰的总和，对工艺改变的过程非常敏感，在整个开发过程中都需要密切监测，以确保一致性。常用的表征方法包括离子交换色谱法和等电聚焦法（2020版药典收录），检测指标包括等电点和酸碱变异体。

聚集分析

抗体分子因为翻译后修饰、运输等的剪切力、杂质、pH值变化等引起蛋白质空间改变，形成空间互补、电荷互补，易产生聚集体。聚集体（或聚集颗粒）是最常见的产品相关的杂质。抗体聚集会增加抗体药物免疫原性，促进抗药物抗体产生，降低药物疗效，所以需要进行密切监控。

常用的分析方法包括：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或毛细管电泳（CE-SDS），用于在变性条件下还原或非还原下测定mAb单体，片段和共价聚集体。体积排阻色谱法（SEC）也是确定单克隆抗体的高分子量聚集物（例如二聚体，三聚体或低聚物）的最常用方法。

对于大型聚集体（颗粒物），可以使用光散射来表征<1nm至1-10μm范围内的颗粒，比如常用的DLS方法，目前对于颗粒物，药典的检测方法包括光阻法（例如HIAC）和显微计数法。微流体成像技术，则被用于大于2-100μm的颗粒物，可以一定程度上区分蛋白质聚集颗粒物和其他异物。