LC3双荧光自噬慢病毒的应用（上篇）——实验原理及病毒使用

吉凯基因

2022.1.26

作者吉凯基因

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自噬是近年来国自然的研究热点之一，那么该研究方向的 “行情”究竟如何？跟小编一起一探究竟吧，目前Pubmed发表SCI情况：从1963年报道至今，共计有65203篇文章发表，并且研究数量呈逐年上升，看到这个趋势，我们紧跟步伐才不会落在别人后面哦。

（图片数据来源于NCBI）

目光转移在国自然方向：自噬在国自然立项以及中标情况也是处于热点地位。

（图片数据来源于梅斯医学）

除此之外，使用吉凯LC3自噬病毒的老师们也纷纷发表了高分文献：

·LC3荧光双标慢病毒系统（stubRFP-sensGFP-LC3 Lentivirus）

2021年4月18日，中山大学附属第三医院消化内科吴斌教授研究团队在自噬领域专业期刊《Autophagy》（2020年影响因子16.016）在线发表了题为“HBx induces hepatocellular carcinogenesis through ARRB1-mediated autophagy to drive the G1/S cycle”的研究论文。该研究阐明了乙肝相关性肝癌癌变过程中的新机制，为乙肝相关性肝癌的防治提供了重要的理论依据及潜在的治疗靶点。

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·LC3荧光双标腺病毒系统（Ad-mCherry-GFP-LC3，GCD0165968):

山东大学附属山东省耳鼻喉医院王海波教授团队与东南大学柴人杰教授合作在自噬领域专业期刊《Autophagy》上发表了题为“PRDX1 activates autophagy via the PTEN-AKT signaling pathway to protect against cisplatin-induced spiral ganglion neuron damage”的文章，阐明了自噬保护SGN免受顺铂损伤的作用，并揭示了PRDX1/PTEN/AKT级联信号通路调控SGN自噬从而发挥保护作用的分子机制。

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自噬研究如此火热，屏幕前的你是不是心动了呢？那么接下来就和小编一起了解一下自噬这个热点研究方向吧~

（一）自噬简介

自噬根据其发生功能的不同分为大自噬（macroautophagy），微自噬（microautophagy），伴侣分子介导的自噬（chaperonemediated autophagy），我们通常所说的自噬一般是指大自噬[1]。

说起自噬，不得不提的就是LC3蛋白啦，是微管相关蛋白轻链3（MAP-LC3）的简称，它全程参与了自噬形成，并且也被用作哺乳类自噬作用的标记蛋白，自噬发生初期，胞浆型LC3（即LC3-Ⅰ）会酶解掉一小段多肽，跟磷脂酰乙醇胺（PE）结合，转变为膜型LC3（即LC3-Ⅱ），并且在自噬体上发生聚集[2]。

（二）自噬的检测方法

第四版的自噬指南整理了自噬的检测方法，主要包括三个方向：

1. 电镜观察

自噬体拥有独特的双层膜结构，普通的电镜就可以很容易观察到自噬体。在自噬的早期研究中，电镜是自噬研究为数不多的检测手段。

2. 荧光显微镜RFP-GFP-LC3融合蛋白示踪自噬形成

使用双荧光自噬慢病毒感染细胞，加入自噬诱导剂后，根据红/绿荧光共定位情况，Merge后的亮黄色荧光点即为自噬体。

3. WB检测自噬水平

主要分为两种：通过前面介绍的LC3蛋白水平指针自噬的降解情况，另一种是基于p62/SQSTM1的检测方案：p62作为自噬的重要受体，主要依赖于自噬途径进行降解。因此，p62的蛋白水平也常常用来指针自噬的降解情况。

了解基本原理后，具体我们应该借助什么样的工具来实现自噬流的检测呢？那小编也不藏着了，是时候请出简单又实用的自噬流的检测工具：LC3双荧光自噬慢病毒闪亮登场啦~

（三）LC3双荧光自噬慢病毒原理

GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是稳定的荧光表达基团，不受外界影响。由于自噬小体进入第二阶段后，与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，导致GFP淬灭，因此，GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。mRFP是一直稳定表达的，因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程[3]。

吉凯设计了LC3双荧光自噬慢病毒，让我们看看这个系统的特别之处吧：

1. 对双荧光系统进行了优化和改造，相较于常用荧光蛋白，该系统使用的绿色荧光蛋白Sens-GFP和红色荧光蛋白Stub-RFP 具有高荧光强度，其激发波长分别为488nm和588nm;

2. 绿色荧光标记Sens-GFP对pH值更为敏感，在自噬溶酶体中淬灭更完全；

3. Sens-GFP和Stub-RFP具有更低的细胞毒性，对细胞状态影响更小。

（四）LC3双荧光自噬慢病毒的使用

自噬慢病毒的使用也十分简单，像普通的慢病毒操作一样，只需要对目的细胞进行病毒感染即可，吉凯的自噬慢病毒具有嘌呤抗性，大家只需要对目的细胞进行感染，随后使用嘌呤进行筛选，最后使用共聚焦显微镜进行拍照分析可以啦。

具体实验流程如下：

1）Day1：细胞感染

细胞感染过表达 SensGFP-StubRFP-LC3 的自噬检测慢病毒（注：自噬检测慢病毒具有 shRNA 表达框，因此可同时在此步骤对待研基因进行敲减操作）后 24hr，加入适宜浓度 Puromycine 药物筛选 3 天，清除未感染细胞。

2）Day4：细胞铺96孔板

铺 1×104 个细胞于 96 孔板中(取决于细胞的大小不生长速度，不同的细胞适度调整)

3）铺板18h后：细胞贴壁

加入 Hochest 对细胞核进行染色

4）共聚焦拍照分析

立即置于 CQ1 中使用 SensGFP、StubRFP 和 Hochest 三通道进行扫板，使用 CQ1的“two colour dots in cellbody”模式进行数据分析。

激发波长

发射波长

绿色荧光Sens-GFP

493

509

红色荧光Stub-RFP

555

584

【参考文献】

[1] Boya P , Reggiori F , Codogno P . Emerging regulation and functions of autophagy[J]. Nature Cell Biology, 2013, 15(8):713-720.

[2] Li F , Vierstra R D . Autophagy: a multifaceted intracellular system for bulk and selective recycling[J]. Trends in Plant Science, 2012, 17(9):526-537.

[3] Zhou C , Zhong W , Zhou J , et al. Monitoring autophagic flux by an improved tandem fluorescent-tagged LC3 (mTagRFP-mWasabi-LC3) reveals that high-dose rapamycin impairs autophagic flux in cancer cells[J]. Autophagy, 2012, 8(8):1215-1226.

[4]第四版的自噬指南链接：Full article: Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition)1 (tandfonline.com)