上一期们介绍了LC3双荧光自噬慢病毒的实验原理及病毒使用，那么后续实验数据如何处理？操作中有哪些小技巧及注意事项呢？今天就跟小编一起挖掘一下吧~
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（一）结果判定标准
1、诱导处理
a) 红/绿色共定位的点状聚集（黄色斑点）：早期自噬小体的生成；
b) 绿色荧光淬灭，只有红色斑点聚集：自噬晚期自噬溶酶体的形成。
2、抑制处理
a) 感染野生型LC3的实验中黄色和红色斑点数量都下降：自噬流在早期被抑制；
b) 黄色上升，红色下降：自噬流在晚期被抑制。
总结成自噬流的判定标准如下表所示：
自噬流变化
本底
自噬流发生
早期抑制
晚期抑制
Red+Green+(黄色斑点）
-上升下降上升
Red+Green-(红色斑点）
_上升下降下降
（二）数据分析
以雷帕霉素（Rapa）药物处理Siha细胞为例（实验数据来源于吉凯平台）。
CON
感染自噬慢病毒，加溶剂处理的细胞
CON+Rapa
感染自噬慢病毒，加100nM终浓度的 Rapa 处理细胞
NC
感染自噬慢病毒,再加入阴性对照慢病毒感染的细胞,分别在细胞贴壁后6H检测
OE
感染自噬慢病毒,再加入目的基因过表达慢病毒感染的细胞，分别在细胞贴壁后6H检测
Average dots count per cell：红色荧光及绿色荧光各组的平均荧光值：
Relative dots Count Red/Green：红色荧光与绿色荧光强度的比值：
相比CON，加入Rapa后自噬体明显增多，自噬流向自噬溶酶体流动，Relative dots Count Red/Green升高(和预实验结果相符），P小于0.05。证明本次实验结果可信。
相比NC组，OE组3个时间点的Relative dots Count Red/Green无明显变化，P大于0.05。提示该基因可能对Siha细胞自噬体向自噬溶酶体的流动无明显作用。
（三）关于实验小Tips
Q
为何细胞感染自噬慢病毒后各个组别
均有自噬体产生？
A：细胞自噬属于正常的细胞生理活动，在饥饿的情况下也会有大量的自噬现象发生，故在培养过程中，注意更换新鲜培养基、 维持细胞密度在80％左右，保证细胞营养充分。
Q
感染后的细胞是否可以直接用于
自噬诱导？
A：自噬慢病毒感染后，由于慢病毒以及感染试剂对细胞有—定的毒性，细胞需要—定的适应时间，并且慢病毒感染后，细胞中荧光标记蛋白表达还不稳定，不能很准确的判断感染效率，故不建议用刚刚感染的细胞进行自噬诱导。一般感染后4天，荧光标记蛋白表达较稳定，细胞状态稳定，可以安排后续自噬诱导
Q
自噬慢病毒已经占据绿色荧光及红色荧
光两个通道，细胞核染色后也会占据蓝
色通道，如果想进行基因调控是否可以
再带其他颜色的荧光呢？
A：一般做自噬流检测我们不建议细胞再带其他颜色的荧光，例如是做基因敲减，有三种解决方案：
1）建议将目的基因shRNA构建在自噬载体上（该载体已经带有红绿荧光），那么进行自噬慢病毒感染即可，该方案的优点是只感染一次病毒，操作简便，缺点是重新构建载体可能会导致更高的成本；
2）选择其他的方式（如真核抗性筛选）建立好目的基因敲减稳定株后，再进行自噬慢病毒的感染，由于LC3自噬慢病毒本身带有嘌呤霉素puromycin抗性，因此建议选择其他真核抗性，如新霉素或潮霉素抗性等，这种方案将需要进行两次慢病毒感染（一次对基因调控建立稳定株，第二次感染LC3自噬慢病毒监测自噬流）；
3）选择其他颜色的荧光，如青色荧光，由于很多荧光都是由绿色和红色为基础衍生而来，并且激发光与发射光直接的重叠也可能会发生影响，后续荧光颜色太多，也可能造成相互的干扰，因此存在一定的风险，下面小编列举了常见荧光的激发光以及发射光波长，给大家参考，选择技巧是尽量保证激发波长直接的距离远一些、不要有重叠，同时，第一种荧光的发射波长不会达到第二种荧光的激发波长：
荧光蛋白名称
激发波长
（nm）
发射波长
（nm）
光量子
结构
相对亮度
（EGFP的百分比）
GFP (wt)
395/475
509
0.77
单体48
绿色荧光蛋白
EGFP
484
507
0.6
单体
100
Emerald
487
509
0.68
单体
116
Superfolder GFP
485
510
0.65
单体
160
Azam Green
492
505
0.74
单体
121
mWasabi
493
509
0.8
单体
167
TagGFP
482
505
0.59
单体
110
TurboGFPGFP
482
502
0.53
二聚体
102
AcGFP
480
505
0.55
单体82
ZsGreen
493
505
0.91
四聚体
117
T-Sapphire
399
511
0.6
单体79
蓝色荧光蛋白
EBFP
383
445
0.31
单体27
EBFP2
383
448
0.56
单体53
Azurite
384
450
0.55
单体43
mTagBFP
399
456
0.63
单体98
青色荧光蛋白
ECFP
439
476
0.4
单体39
mECFP
433
475
0.4
单体39
Cerulean
433
475
0.62
单体79
CyPet
435
477
0.51
单体53
AmCyan1
458
489
0.24
四聚体
31
Midori-Ishi Cyan
472
495
0.9
二聚体
73
TagCFP
458
480
0.57
单体63
mTFP1 (Teal)
462
492
0.85
单体
162
黄色荧光蛋白
EYFP
514
527
0.61
单体
151
Topaz
514
527
0.6
单体
169
Venus
515
528
0.57
单体
156
mCitrine
516
529
0.76
单体
174
YPet
517
530
0.77
单体
238
TagYFP
508
524
0.6
单体
118
PhiYFP
525
537
0.39
单体
144
ZsYellow1
529
539
0.42
四聚体
25
mBanana
540
553
0-7
单体13
橙色荧光蛋白
Kusabira Orange
548
559
0.6
单体92
Kusabira Orange2
551
565
0.62
单体
118
mOrange
548
562
0.69
单体
146
mOrange2
549
565
0.6
单体
104
dTomato
554
581
0.69
二聚体
142
dTomato-Tandem
554
581
0.69
单体
283
TagRFP
555
584
0.48
单体
142
TagRFP-T
555
584
0.41
单体99
DsRed
558
583
0.79
四聚体
176
DsRed2
563
582
0.55
四聚体
72
DsRed-Express (T1)
555
584
0.51
四聚体
58
DsRed-Monomer
556
586
0.1
单体10
mTangerine
568
585
0.3
单体34
红色荧光蛋白
mRuby
558
605
0.35
单体
117
mApple
568
592
0.49
单体
109
mStrawberry
574
596
0.29
单体78
AsRed2
576
592
0.05
四聚体
8
mRFP1
584
607
0.25
单体37
JRed
584
610
0.2
二聚体
26
mCherry
587
610
0.22
单体47
HcRed1
588
618
0.015
二聚体
1
mRaspberry
598
625
0.15
单体38
dKeima-Tandem
440
620
0.24
单体21
HcRed-Tandem
590
637
0.04
单体19
mPlum
590
649
0.1
单体12
AQ143
595
655
0.04
四聚体
11
1.实验技术干货
2.蛋白质组学研究
3.腺病毒简介及应用
4.临床基础研究思路解析
5.组织特异性腺相关病毒
6.单细胞测序
7.慢病毒实验操作指南
8.悬浮细胞专用病毒
9.靶点设计/数据库教程
10.测序技术研究与应用
11.非编码RNA研究技术与应用
12.腺相关病毒选择/应用
13.表观遗传研究
14.文章解析
15.国自然课题设计思路解析
16.生物信息分析及工具
17.外泌体研究
18.肿瘤免疫研究
19.高分文章
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