做显微成像这么久，镜头你真的会选吗？

在使用各类显微镜时，我们普遍希望能够获得清晰且明亮的理想图像。从专业角度讲，获得高质量的图片需要各项光学技术参数达到一定的标准，并且要结合使用的场景协调各参数的关系，才能最大程度的发挥硬件的性能，得到满意的结果。那么显微镜的光学技术参数都有哪些呢？

显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深（景深）、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的。在使用时，应该要保证分辨率的情况下，根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，最终拿到满意的结果。

在众多的参数中，数值孔径无疑是最重要的一个。数值孔径（NA）是一个无量纲的数，也就是说，它没有单位，只用以衡量一个光学系统（镜头）能够收集的光的角度范围。NA 是透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（2α）半数的正弦之乘积。用公式表示如下：NA = n * sin α。孔径角又称 “镜口角” ，是透镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。简单来讲，孔径角越大，进入透镜的光通量就越大，它与透镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。NA 表示了镜头收光锥角的大小，而这也决定了显微镜收光能力和空间分辨率，是判断镜头性能高低的重要标志，其数值的大小，一般标刻在镜头的外壳上。

用显微镜观察时，若想增大 NA 值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率 n 值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜以及其他介质的物镜，因介质的折射率 n 值大于 1，NA 值就能大于 1。数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。

显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称“鉴别率”。简化的计算公式是 σ=0.61λ/NA ，式中 σ 为最小分辨距离；λ 为光线的波长；NA 为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的 NA 值与照明光源的波长两个因素决定。换句话讲，想要获得好的分辨率，在 NA 值相同的情况下短波长比长波长的光分辨率更高，也就是说，在选择光源的时候，合适波段的染料也能提高分辨率。

物体在成像过程中经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率是物镜放大率和目镜放大率的乘积，显微镜放大倍率的极限即有效放大率，对于没有目镜放大的高内涵来讲，放大倍率不能简单的理解为镜头放大，还要结合不同倍率下检测器对应的标尺来判断。

焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层。

工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。工作距离最直接的影响因素是支撑耗材的厚度，常用的耗材材质有塑料、玻璃和类玻璃，国际上规定，盖玻片的标准厚度为 0.17mm ，许可范围在0.16 - 0.18mm，而类玻璃为 0.2mm 左右，这两种材质都是显微成像技术中最优质的耗材，可适配的镜头工作距离也相应做了调整，而对于高内涵而言，常用的耗材是塑料材质的孔板，这一类耗材品质参差不齐，有的可以做到 0.3mm，有的甚至可以厚达 1.2mm，所以，高内涵所用的镜头增加了一个长工作距离的参数，就是为了兼容更多的板材，在更高的倍数下，用塑料孔板也能拍到清晰的图像。

除此之外，高内涵还有一个普通显微镜视场数衍生出的概念，即视野。通用物镜的视场数 FN 是一个固定值，视野= FN /放大倍率，高内涵没有目镜，目镜的功能由相机承担，因此，相机的感光芯片的大小决定了我们能够看到图像的范围，不同的是，视野是可以叠加和拼接的，所以不同倍率的物镜下，我们想要得到图像的范围不受约束，高倍镜也可以通过增加视野数获得和低倍镜相同的视场范围。

Molecular Devices IXM 系列的高内涵可配备多种高质量的镜头，按适配介质分有三类，分别是 1-100 倍的空气镜，20X、40X、60X 的水镜，40X、60X、100X 的油镜。空气镜有工作距离长短的区分，如前文所讲，长工作距离（ELWD）的镜头 NA 值偏低，分辨率也偏低，但适用于绝大部分的板材，适用场景丰富，符合大部分不追求极致分辨率的应用。此外，空气镜也有工作距离较短的镜头（SWD），这些镜头分辨率较高，NA 值较高，适用于大批量成像且追求一定图像质量的应用，也可以配合共聚焦成像拍摄 3D 样品。由于介质的限制，水镜和油镜的工作距离是固定的，相同倍率下水镜的工作距离要高于油镜，但是这两种介质都能提高 NA 值和分辨率，因此在选择的过程中，需要考虑拍摄样本的情况，比如，小批量的拍摄高清细胞器的应用，推荐选择油镜，而大批量拍摄高清细胞形态的应用，比较推荐选择水镜。

除此之外，传统镜头在成像时，整颗镜头都可以等效成一个凸透镜。但镜头不能只由一个凸透镜组成，因为它存在像差和色差。于是镜头需要由多片镜片组成，每一片都有各自的职责，有的负责偏转光线，有的负责消除色差，有的负责消除畸变。每一片镜片都需要经过复杂的研磨过程，装配时也需要极高的精度。因此，镜头上还会配有其他相关参数，如下所示：

正如前文所讲，镜头的参数是互相影响又互相制约的，在选择镜头的时候，一定要兼顾所拍摄样品的具体情形。一般来讲，倍率要低中高各有一个， APO 复消色差推荐选择 20 倍或者 40 倍镜，高倍率镜头选择长工作距离（ELWD）比较稳妥，极致细节成像选择高倍油镜或者高倍 APO 空气镜，大批量拍摄高质量照片或者 3D 样品选择水镜。

最后，为确保显微镜系统的最高性能，推荐定期清洁物镜。分享一些关于镜头清洁的小 tips：

①除尘：用吸耳球吹去灰尘，使用软刷或棉布清除残留的灰尘。

②去除指纹或油脂：用蘸有无水乙醇的镜头清洁纸（或柔软的棉布）擦拭。

①浸没的水蒸发后，水中的灰尘可能会残留在镜头上，且不易用无水乙醇去除。为防止出现此情况，应在水蒸发前，每次使用物镜后进行清洁。

②如果仍有灰尘，请用蘸有蒸馏水或超纯水的擦镜纸轻轻擦拭镜头。

③按照“干镜的清洁”的步骤②所述，用浸有无水乙醇的擦镜纸清洁物镜。

①用浸有石油醚的擦镜纸彻底擦去镜油。

②按照“干镜的清洁”的步骤②所述，用浸有无水乙醇的擦镜纸清洁物镜。该方式同样适用于硅油浸入物镜。*如果无法获得石油醚，也可以使用无水乙醇。但是，由于无水乙醇的去污力很弱，因此可能需要多次擦拭（ 3 - 4 次）。