使用等重同位素标记和ZenoTOF™ 7600
系统分析蛋白表达
ZenoTOF™ 7600 系统以高达每秒200 MS/MS 的速率采集高分辨率的MS/MS谱图（>30,000的分辨率）。
MS/MS 采集模式（Zeno™ IDA 和 Zeno™ MRMHR）下，Zeno™ trap 使得整个质量范围内的占空比（duty cycle）提高到 ≥90%，从而将 MS/MS 灵敏度提高 4-20倍。
微升液相和 OptiFlow Turbo V™ 离子源用于iTRAQ™等重同位素标记的蛋白质组样本的高通量、稳定分析。
Zeno™ MS/MS技术成功的关键是可以产生丰富信息的MS/MS二级谱图和高丰度的iTRAQ™试剂报告离子，其中前者用于鉴定肽段，后者保证定量分析的准确性。
ZenoTOF™ 7600如何提高肽段和蛋白质鉴定水平?
使用MCF-7，A549 ，HeLa和K562四种细胞酶解产物，用 8plex iTRAQ™ 标记。K562 用 113 和 117 试剂标记，HeLa 用 114 和 118 试剂标记，A549 用剂 115 和 119 试标记，MCF-7 用 116 和 121 试剂标记。混合标记的样本，使用高 pH RP-HPLC将肽混合物分级为 44 个组份。
分别在开启 Zeno™ trap 和不开启 Zeno™ trap情况下，使用 DDA采集模式，在 ZenoTOF™ 7600 系统上采集各组份的数据。使用 OneOmics 软件包中的 ProteinPilot 应用程序处理数据。
启用 Zeno™ trap，提高了MS/MS 二级谱图灵敏度，从而鉴定出 6,505 种蛋白质和 88,411 条肽段（1% Global FDR）。启用 Zeno™ trap 的采集数据比没有启用 Zeno™ trap 的多鉴定出大约 24% 的蛋白质和 94% 的肽段（图 1）。
图 1. Zeno™ MS/MS 提升蛋白质
和肽段的鉴定数量
图2突出显示了Zeno™ trap提升了 MS/MS二级谱图质量，二级碎片离子信号强度增加大约 6 倍，报告离子信号强度增加 10 倍以上。
图 2. Zeno™ trap显著提高 MS/MS 二级谱图质量。
可以看出使用 Zeno™ MS/MS 显著提高了
肽段碎片离子和报告离子的信号强度。
ZenoTOF™ 7600如何显著增加iTRAQ™试剂报告离子强度？
使用 Zeno™ trap，在 MS/MS 质量范围内的二级离子的占空比（duty cycle） 增加到 ≥90%。这意味着较高 m/z 区域的灵敏度增加约 5 倍，较低 m/z 区域增加高达 10-20 倍。为确认其对 iTRAQ 报告离子的影响，测定 MS/MS 谱图中所有观察到的报告离子的峰面积，得到峰面积分布图（图 3）。启用 Zeno™ trap 的报告离子峰面积的平均值比没有启用 Zeno™ trap高约 10 倍。
图 3. Zeno™ MS/MS 显著增加 iTRAQ™
试剂报告离子的信号强度
ZenoTOF™ 7600如何提高蛋白质定量的质量？
iTRAQ™等重同位素标记的蛋白质定量可以测定混合样本中的蛋白质的相对含量，通过测定报告离子与选定对照离子的峰面积比值来实现。以K562 的 113 标记试剂作为对照离子，通过报告离子峰面积与 113 离子峰面积比值来测定不同样本的肽段含量比值。Zeno™ MS/MS 增加94%的肽段鉴定数量（图 1），提高蛋白质的氨基酸序列覆盖度以及通过增加报告离子强度提高肽段定量的质量，从而提高了蛋白质定量分析。
ZenoTOF™7600如何发现显著变化？
最后，评估两个实验之间的蛋白质含量比值，以确定它们在统计学上存在显著变化的蛋白质数量。将数据绘制为火山图（图 7），通过比值的对数倍数与 P 值的对数的关系来突出定量数据的分布。启用 Zeno™ trap，P 值 < 0.001 （Log P-valve < -3）时，共 814 种蛋白质在细胞系之间存在差异表达。这明显高于没有启用 Zeno™ trap的情况，只有 131 种蛋白质的表达有显著差异。
图 7. 火山图显示细胞系之间的差异蛋白
结论
使用 iTRAQ™ 试剂分析蛋白质差异表达，需要鉴定到大量的肽段信息，同时需要在MS/MS 二级谱图的低 m/z 区域有较高的灵敏度，该区域提供高质量水平的定量信息。Zeno™ MS/MS 大大提高了 MS/MS 的灵敏度，肽段碎片离子的信号增益为 5-6 倍，报告离子的信号增益约为 10 倍。通过比较启用 Zeno™ trap 和不启用 Zeno™ trap 时采集的大规模预分级实验数据，可以看出Zeno™ trap 增加的灵敏度可以提高约 24% 的蛋白质鉴定数量和94% 的肽段鉴定数量。大部分鉴定到的蛋白质（95%）都可以用于定量分析，这提供了一个由 6,186 种蛋白质组成的丰富的蛋白质表达数据集。这些数据在24 小时内就可以采集完成。
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参考文献
1. Ross et al. (2004) Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents, Mol Cell Prot, 3(12), 1154-1169.
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3. Qualitative flexibility combined with quantitative power. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-13053-A.
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5. Single source solution for low flow chromatography. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-9701-A.
6. ProteinPilot report. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-1778-B.
7. Downloading and viewing ProteinPilot app group files on your desktop and extracting key exports. SCIEX community post, RUO-MKT-18-12201-A.
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