抗体药物质量分析

抗体药物质量分析

抗体是一种结构复杂的生物大分子，由多个氨基酸组成。即便是天然的抗体，其结构也是各不相同。抗体药物中使用到的单克隆抗体(IgG)在生产工艺(细胞培养、分离纯化)与保存过程中易发生不均一性的变化，包括抗体蛋白的二聚体、多聚体、脱酰胺化、末端氨基酸突变以及糖链部分的结构差异。这些不均一性会使药物的药效、安全性方面受到影响。抗体药物质量分析就是对影响抗体药物药效的关键质量属性进行鉴定，主要包括分子序列、高级结构、寡糖分布、异质性(分子大小/电荷异质性)、活性和杂质等，具体内容如下。

分子大小：聚集，片段化，高、低分子量变体。

序列鉴定：氨基酸序列、N末端测序、C末端测序。

高级结构：蛋白质二级&三级结构，二硫键配对是否正确，自由巯基，热力学稳定性。

电荷异质性和氨基酸修饰：PI及不同PI组分的相对含量，酸性形式（脱氨基化，唾液酸化等），碱性形式（氧化&C末端赖氨酸修饰变体）。

糖基化修饰：糖基化位点、半乳糖甘化、唾液酸化、甘露糖基化、岩藻糖基化。

稳定性：在架时间、降解属性。

杂质：产品相关杂质、宿主细胞蛋白（HCP）、蛋白Aleakage、细胞培养成分、DNA、内毒素、肉眼不可见颗粒。

生物活性：总浓度、活性浓度、目标结合活性、效应分子结合活性（如FcR结合）。

活性测定：作用靶点、CDC、ADCC、凋亡等。

分析仪器：

一般抗体使用最多的就是LC-MS/MS来分析，同时可测分子量大小，蛋白质结构，二硫键等。其中高分辨质谱可以说是抗体必要的仪器了。

我们推荐Waters XEVO G2-XS Q TOF,Q-TOF高分辨质谱仪广泛用于分子量测定、肽图、二硫键和糖基化分析等方面

Thermo QE 系列高分辨质谱

对于抗体质量结构，还有一个利器就是毛细管电泳系统，可以分离各种不同的样品，包括：肽类、蛋白、核酸、离子、手性化合物和药物，u毛细管电泳比其他分析仪器需要更为少量的样品（5-30微升，进样的量仅5-50纳升）。它可以提供比其他分离技术更为理想的分析手段。

我们推荐BECKMAN PA800 PLUS

抗体杂质分析—基于多维液相色谱和高分辨质谱联用进行杂质鉴定

可以消除流动相对质谱的限制，直接鉴定磷酸盐、离子对试剂等不挥发盐液相条件下的杂质，杂质鉴定工作变得简单

与高分辨率质谱联用可快速在线检测任意色谱方法分离出的相关杂质分子量

与高分辨率质谱联用可快速在线判定单抗产品杂质的氨基酸残基修饰类型及位点

可高快速且大量分离富集产品相关杂质以供多项测试服务

高通量筛选单克隆抗体克隆细胞株

生物学活性测定

抗体药物的质量控制不仅包含药物本身的质量一致性，还需要对抗体药物的生物活性进行质量控制，生物活性测定主要结合活性测定及生物学活性测定。其中，活性测定是对药物的有效成分、含量以及药物效价的测定，是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。对于抗体偶联药物来说，DAR(药物抗体偶联比)也是一项重要的质控指标。随着抗体药物的不断发展，如何对抗体药物的质量研究与评价提供新型测定方法，是抗体药物产业发展面临的巨大挑战。

1.抗原结合能力测定

目前研发生产中主要通过测定抗体的抗原结合能力来评价活性，常用的方法有ELISA法和流式细胞仪法;一些新技术测定法如SPR技术。另外还可以模拟抗体的作用机制，测定其体外生物学活性并进行评价。

ELISA法测定抗体的抗原结合能力一般需要具备相应的可溶性抗原。对待测抗体浓度、吸光值作四参数拟合，可得到反“S”形曲线，以曲线的IC50 值评价抗体的抗原结合能力。ELISA方法操作比较简单、耐用性好，为避免标记抗体活性或其他试验因素对测定结果的影响，必须有标准品进行平行操作。

流式细胞仪法测定与ELISA法测定原理基本相同，不同的是将可溶性抗原变为细胞，并通过流式细胞仪测定细胞的阳性率指标来检测待测抗体与标记抗体的竞争结合情况。该方法的优点是选用携带抗原的细胞进行检测，细胞表面的抗原空间结构更接近体内存在形式，使待测结果更接近实际情况，另外该方法还避免了相应抗原的制备纯化过程，对于不易获得可溶性抗原的抗体可采用该方法进行测定。

2.新技术测定

基于新技术的生物学活性测定方法主要有表面等离子共振效价测定法(SPR)、均相时间分辨荧光、 Alpha 技术、荧光染料标记法等。

表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)是一种用于生物分子间相互作用分析的新技术，已经成为抗体领域分子互作的“金标准”并被FDA收录。该技术测定抗原抗体结合活性时不需要标记，避免了标记对分子结构的影响，能更加真实地反映抗原抗体的结合情况。它测定周期短，样品用量少，一般仅有微克级，可用于微量样品的测定。同时使用亲和力信息及动力学信息来阐述分子间结合机理。

均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法，也是用来研究药物靶标的理想平台。该技术结合了荧光共振能量转移(FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer)和时间分辨荧光(TRF，Time Resolved Fluorescence))两种技术。HTRF技术进入药物研发领域以来，加快了很多基于抗体的研究，因为HTRF具有同等的检测范围和检测极限，不需要洗涤步骤，实验方式操作简单，而且减少了实验时间和花费。所以该技术近年来已被应用于抗体的活性检测。

Alpha技术(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)也应用于抗体的活性检测，该技术需要两个由不同的化学混合物组成的微珠，分别为供体微珠和受体微珠。近年来抗体等生物大分子的迅猛发展，Alpha技术依靠其自身的优势和特点，能够应用到各个研究领域，包括血管生成、癌症、心血管、炎症、等多种疾病领域。特别是在药物研发领域，由于其稳定的、高灵敏的、可自动化的、可重复且低成本的特点，它将会受到越来越多的科研工作者的青睐。

荧光染料标记法已被广泛应用于蛋白质标记、DNA检测、医药卫生和环境检测等领域。近年来BODIPY(氟化硼二吡咯)类荧光染料作为一类新型的荧光染料，由于其优良的性质和广阔的应用前景在过去的二十年内得到广泛的研究。与其它的荧光染料相比，BODIPY类荧光染料的光谱峰宽比较窄、检测灵敏度较高、较高的摩尔吸光系数、光稳定性能非常优越以及较高的荧光量子产率等。

3.基于转基因细胞生物活性测定

报告基因细胞株(Reporter cell line)被认为可以克服传统细胞水平分析方法缺点而被逐步广泛运用到新药研发的进程中。报告基因细胞株以药物作用机制(MOA)为基础，在细胞内建立起靶点转导信号与报告基因表达的相关性，通过检测报告基因的表达情况以监控靶点信号通路转导，进而构建一种药物靶点特异性的模型细胞株。这类细胞株批间差小，且转入细胞内的检测信号强，以此为基础开发的分析方法灵敏度高，检测周期短，重复性好，并且操作简单。