磁珠富集病原体，污水检测“黑科技”

赛默飞生命科学

2023.2.06

作者赛默飞生命科学

TA的动态

2022年12月，为指导全国各地做好当前新型冠状病毒感染疫情监测工作，国务院应对新型冠状病毒感染疫情联防联控机制综合组制定了《新型冠状病毒感染“乙类乙管”疫情监测方案》，其中“监测内容和方法”中首次明确提出了“新冠病毒污水监测”，可“选择有条件的城市布点探索性开展污水监测，采集污水处理厂污水样本开展新冠病毒核酸检测”等（图1）。

图1. 图片内容来源于《新型冠状病毒感染“乙类乙管”疫情监测方案》

随后，2023年1月初，国务院联防联控机制发布《新型冠状病毒感染防控方案（第十版）》，在“监测预警”中再次提到“城市污水监测”，具体为“各地可选择有条件的城市开展污水中新冠病毒监测工作，动态评估新型冠状病毒感染疫情流行强度、变化趋势及病毒变异情况”（图2）。由此可见，“污水监测”的重要性日益凸显。

图2. 图片内容来源于《新型冠状病毒感染防控方案（第十版）》

其实，早在2020年SARS-CoV-2的大流行开始，世界各地多个组织就已经开始在研究SARS-CoV-2的监测手段。利用污水监测该病毒在地区或城市层面的传播，现已被证明是一种可靠的方法。根据检测频率的不同，污水监测可以作为社区感染变化的一个领先指标，帮助相关部门在疫情蔓延之前建立有效防控。

污水监测还有助于评估新冠病毒的传播，全球多个国家和地区在2020年疫情爆发之后开始建立污水监测系统，定期对污水样本取样并检测。下图展示了香港地区建立污水监测的时间线（图3），早在2020年12月，香港政府就利用污水监测发现了社区里的隐性感染者的存在。

图3. 香港地区建立污水监测的时间线

传统污水检测实验方案面临很多挑战，比如污水经过高度稀释，病毒颗粒和核酸的丰度比较低，样本的高度异质性等。因此，病毒浓缩在污水检测工作流程中是必需的。下图即为常用的污水检测实验流程（图4）。

图4. 污水检测实验流程

2022年3月24日，国家卫健委发布了《污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法标准》（下文中将简述为《污水标准》）。该《污水标准》中详细描述了污水样本的几种富集浓缩方法，可采用聚乙二醇沉淀法或铝盐混凝沉淀法和离心超滤法进行浓缩，浓缩后终体积基本在1 mL左右。

图片来源于网络

随着样本量的增加，能够实现污水中病毒富集和提取的自动化，成为当前的热点需求。赛默飞开发出了5种污水样本的富集及提取SARS-CoV-2病毒RNA的全流程解决方案。方案中用到的核酸提取试剂盒就是针对污水样本推出的MagMAX重磅新品——MagMAX Ultra污水核酸分离试剂盒。

下面将概述3个具有代表性的方法，针对不同体积起始量的污水样本进行SARS-CoV-2检测。

使用磁珠进行病毒富集处理10 mL污水样本

采集到污水样本后对其进行热灭活，并在4°C下储存。使用Dynabeads病毒富集磁珠搭配KingFisher自动纯化系统进行病毒富集。然后，使用MagMAX Ultra污水核酸分离试剂盒进行病毒核酸纯化，最后使用针对SARS-CoV-2的Applied Biosystems™ TaqMan检测试剂盒，在Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5或7实时荧光定量PCR系统上进行qPCR分析（图5）。

（点击查看大图）

图5. 10 mL 污水样本磁珠法浓缩自动化工作流程

如图6所示，我们发现， 100 μL Dynabeads磁珠可以在10分钟内快速浓缩10 mL污水样本中的病毒，病毒捕获效率接近100%，实现了SARS-CoV-2 RNA的qPCR稳健检测。

图6. 10 mL污水样本中SARS-CoV-2 RNA检测。对10 mL污水样本使用Dynabeads病毒富集磁珠浓缩病毒，并进行自动化核酸纯化后，采用qPCR检测掺入灭活的SARS-CoV-2（4,000个拷贝数）。未浓缩的2 mL PBS对照品中同样掺入灭活的SARS-CoV-2（4,000个拷贝数）。

10mL体积工作方案同样可以成功检测出其它病毒和细菌靶标，数据见图7。

图7. 10 mL污水样本中其它病毒和细菌靶标检测处理。对10 mL污水样本使用Dynabeads病毒富集磁珠富集浓缩病毒，进行自动化核酸纯化后，采用qPCR检测掺入ZeptoMetrix Respiratory Panel Controls进行检测。

处理1 mL直接或预浓缩的污水样本

采集到污水样本后对其进行热灭活，并在4°C下储存。污水样本可直接用于下游核酸提取，也可使用《污水标准》中所述富集浓缩方法即沉淀法、离心超滤法进行病毒浓缩，或使用其他方法如超速离心法或过滤法，预富集浓缩至最终体积为1 mL的污水样本。

（点击查看大图）

图8. 1 mL预富集浓缩或非富集浓缩污水样本自动化工作流程

我们发现，无论是否预先进行病毒浓缩，使用MagMAX Ultra污水核酸分离试剂盒和KingFisher自动纯化系统可以有效地处理1 mL体积的样本。非浓缩样本的qPCR分析结果如图9所示。

图9. 1 mL直接或预浓缩污水中SARS-CoV-2 RNA检测。对1 mL污水样本进行自动化核酸纯化后，采用qPCR检测掺入灭活的SARS-CoV-2。未浓缩的1 mL PBS对照品同样掺入灭活的SARS-CoV-2（高拷贝[掺入]为2,800个拷贝数，低拷贝[掺入]为140个拷贝数）。

经过滤浓缩处理的50 mL-500 mL污水

随着污水量的增加，磁珠辅助病毒浓缩的效率逐渐降低。对于50 mL样本，典型的磁珠病毒回收率为50%。因此，我们开发了一种可替代的病毒浓缩方法用于50 mL-500 mL的污水。如图10所示，使用真空装置过滤是一种浓缩大量污水的有效方法。采集到污水样本后对其进行热灭活，并在4°C下储存。使用真空装置过滤，滤膜经MagMAX Ultra污水核酸分离试剂盒处理后，配合KingFisher自动纯化系统进行自动化核酸提取（图10）。qPCR分析结果如图11所示。