2022年末AutoChrom竞赛优秀答案之二

2022末AutoChrom

竞赛优秀答案之二

2022年末AutoChrom竞赛参考答案与获奖名单已于上周公布，大家对高分大神的答卷是否很好奇呢？

本周，ACD/Labs将陆续公布竞赛前三名的优秀答案，供大家学习和参考！

本次分享的优秀答案来自武汉嘉诺康医药技术有限公司的蒋潇潇老师。

01

在下图的logD叠合图里，黑色箭头所指的曲线代表列表中的几号物质（编号1-9），请阐述判断的原因。

答：黑色箭头所指的曲线代表列表中的9号物质：LogD曲线呈现S形，随着pH增加logD值先下降后不变，典型的酸性化合物，以上9个化合物中ID9化合物有磺酸根基团，且LogD值在pH5~14约为-4，磺酸根电离后有较大的极性，logD值较小。此外苯磺酸为强酸，pka在-0.4左右，表现在pH较小时logD曲线开始发生变动。

02

在进行pH 筛选时，获得了以下的筛选结果。请根据色谱行为判断以下7个物质的酸碱性特点。请选择以下您最满意的一针，并阐述理由。

答：杂质B、杂质H、杂质I:中性化合物，保留时间在研究的pH范围内（2.0~7.0）随pH增加不发生变化（或者pka在9以上的弱酸或强碱，在pH2.0~7.0范围内，电离形态单一，也可能发生保留时间不随pH发生变动的情况）；

1、杂质D、API、2：酸性化合物，pH3.0到pH7.0，保留时间减小；API和2性质比较类似，pH2.0到pH3.0，保留时间稍有减小，pH3.0到pH7.0，保留时间减小的趋势比较类似；1，pH2.0到pH3.0，保留时间稍有减小，保留时间减小的程度pH3.0到pH5.0比pH5.0到pH7.0的大；杂质D，pH2.0到pH7.0，保留时间一直在减小。杂质D的酸性在4个酸性化合物中最强。

pH5.0的结果比较优选，在梯度洗脱时间内所有色谱峰均匀分布，所有相邻色谱峰间的分离度也较好,此外应考虑pH在5.0的耐受性情况，补充考察pH5.0±0.5单位内分离情况。

03

如图化合物，在杂化C18耐碱色谱柱上进行筛选时，不同的pH下主峰峰形以及保留时间存在有趣的变化，请基于物质结构描述主峰峰形以及保留时间变化的原因。

答：根据ACD软件logD曲线及酸碱pka预测，可以得到如下信息：

酸性pka1.4±1.3，碱性pka4.8±1.0；既有酸性基团，又有碱性基团，logd曲线在pH0~14范围内，随着pH增加，先升再有一段平台后降再有一段平台，在pH8.5~14为平台，在此pH范围内，化合物的电离形态应该是单一的，因此pH9.2、9.7、11.0、11.5峰型及保留有很大差异，与电离形态无关，可能的原因为结构中含有活泼羰基，导致在pH9.2、9.7、11.0条件时，羰基与水、醇发生加成反应，导致有不同的形态-羰基原形酮、水合半缩酮、醇合半缩酮，跨越某个高pH后，亲核反应被抑制，峰型变好。

pH1.6高氯酸溶液，保留最强，峰型也较好：logD曲线上pH1.6的疏水性大于碱性条件，因此保留也较强，峰型好也能为pH1.6时，氮质子化带正电后，高氯酸作为离液试剂，增强碱性化合物的保留，同时可以改善碱性化合物的峰型。

假设在pH9.2、9.7、11.0条件时，环酮发生反应生成醇合半缩酮，图中logD曲线可以看出产物的疏水性在pH9.2~10比原形大，因此色谱保留上保留更强，但峰型更差。

04

硅胶基质相同但孔径不同的色谱柱其特性也会有明显的不同，如下图ACE 5 C18, ACE 5 C18-300色谱柱的TANAKA测试结果。

请问：用同样的中性条件运行相同的梯度来分离以下1，2号化合物，上下两张色谱图中，哪张是ACE 5 C18-300的结果？这和TANAKA柱效测试的哪个参数最相关？请加以阐述。

答：下图是ACE 5 C18-300色谱柱的运行结果，与TANAKA柱效测试的Retention Capacity参数最相关。从TANAKA柱效测试的6个维度的结果对比，孔径为100A和300A两个色谱柱的Retention Capacity数值差异较大，分别为5.44、2.41，对于化合物1和2属于小分子范畴，孔径100A时分子进出孔隙与键合相发生作用更多，300A时孔径较大溶质分子进出孔隙与键合相发生作用弱于100A，在保留上表现为300A疏水保留能力弱，保留时间小。

此外，ID1和ID2的出峰顺序与Logd曲线中表现出的疏水能力相反，ID2的logD在中性条件下比ID1的小，但后出峰；主要原因为ID2比ID1结构上多了六元环的羟基部分，与色谱柱有更多的氢键作用，这种作用使得ID2保留更强，在ID1之后出峰；这两根色谱柱（100A和300A）氢键作用力数值分别为0.38、0.35，差异不大，均有一定的氢键作用，均表现为ID2在ID1之后出峰，300A色谱柱上1和2之间的分离度更好。

05

Intersil ODS-3 色谱柱和SB-C18 色谱柱在物质的保留上有相似之处也有不同之处，请结合有图TANAKA 柱效测试的数据比较的结果解释左图的保留行为现象。

*注释，左下图的线性较好的实心菱形为中性化合物，且基本无杂原子取代基团

答：① 基本无杂原子取代基团的中性化合物在Intersil ODS-3 色谱柱和SB-C18 色谱柱的保留因子具有很好的线性：logk（Intersil ODS-3）=1.01*logk（SB-C18）+0.21，r2=0.995，线性关系良好，原因：对于无杂原子取代的中性化合物，在pH2.8的磷酸溶液的流动相条件下，也不会发生和色谱柱之间的离子交换作用，保留行为受疏水作用主导，即色谱柱的Retention Capacity值越大，保留越强，Intersil ODS-3和SB-C18的Retention Capacity值分别为7.74、6.00，因此对于同一个中性化合物在Intersil ODS-3色谱柱的保留因子k大于在SB-C18 色谱柱的保留因子k，与图中的线性数学关系式相符；

② 而对于碱性化合物，保留因子在SB-C18 色谱柱和Intersil ODS-3色谱柱上差异较大，是疏水作用力和离子交换二者共同作用的结果，疏水作用力Intersil ODS-3色谱柱大，但离子交换能力SB-C18大。在pH2.8的磷酸溶液的流动相条件下，对应色谱柱TANAKA 柱效测试的Ion Exchange Capacity pH2.7，在pH2.7条件下的离子交换能力（残余羟基活性），由于SB-C18不封端，硅胶上残留羟基比Intersil ODS-3多，离子交换能力强，对碱性化合物保留能力强（碱性化合物溶质在pH2.7条件下质子化，可以和色谱柱上的羟基发生离子交换作用）。

06

与传统杂化C18色谱柱相比，硅胶球表面带有电荷的色谱柱的保留行为会有所不同。如下图安捷伦公司的CS-C18。请结合物质结构以及logD图，分析解释CS-C18色谱柱上保留行为与HPH-C18色谱柱的差异性。

答：CS-C18色谱柱表面带正电荷，和HPH-C18色谱柱相比，可以与带电溶质发生离子静电作用。化合物8和9，有羧基，pka在2.5左右，可能在分析的条件下，羧基电离带负电荷，与CS-C18色谱柱上的正电荷发生静电引力，从而保留增强。

化合物1,2,3,4,5,6,7保留在CS-C18色谱柱上均比HPH-C18有所减弱，均含有碱性基团，质子化带正电后和CS-C18色谱柱上的正电荷发生静电排斥作用，使保留减弱。

化合物1与4相比，化合物4在氮杂环上上多了乙基，含有氨基，有弱碱性，pka分别为8.6、8.0；化合物2与3相比，化合物2在第3个六元环上多了一个羟基含有氨基，有弱碱性，pka分别为9.0、9.4；化合物5与6相比，化合物6在氮杂环上上多了2个甲基，均含有氮，有很弱的碱性，pka分别为2.1、3.1；化合物7中含氮部分，pka为8.6；化合物5和6保留时间减小的程度最小，碱性较弱。

同时化合物1,2，3,4的色谱峰峰型上，峰展宽在CS-C18色谱柱上比HPH-C18要大，可能是因为除了正电荷的排斥作用外，化合物结构上的羧基，羰基等含氧官能团还可能与色谱柱上的正电荷发生引力作用。

07

下图是一个研究员的两因素两水平优化实验设计及其谱图，请基于谱图指出不同因素对色谱峰形态，保留以及分离的影响，识别四张典型谱图中的所有风险，给出下一步优化的方向。

答：G1 20%~50% B相20min梯度，G2 20%~50% B相40min梯度，两个梯度下柱温45摄氏度主峰14峰型均优于25摄氏度；G1梯度下，化合物13/14/15不是在有效梯度20min内被洗脱；G2梯度下，化合物15不是在有效梯度40min内被洗脱；

在同一梯度下，温度对于不同化合物的影响不一致，部分化合物（7~15）保留时间随着温度升高而增大，部分（2/3/5/6）随温度升高而减小，部分（1、4）差异不大：

G1梯度时，柱温25摄氏度到45摄氏度，温度升高，化合物2/3分离变差（共洗脱），化合物6/7分离度变好，化合物8/9出峰顺序反转，化合物11/12出峰顺序反转，化合物13/14分离变差（接近共洗脱）；

G2梯度时，柱温25摄氏度到45摄氏度，温度升高，化合物2/3分离变差（共洗脱），化合物6/7分离度变好（由共洗脱，变得分离很好），化合物8/9出峰顺序反转（分离度变差），化合物13/14分离变差；

25摄氏度时，梯度拉缓，化合物6/7分离变差；45摄氏度时，梯度拉缓，7/9分离变差，11/12分离变好，13/14分离变好；

G1 25摄氏度，2/3 和13/14这两对化合物的分离度最差；

G1 45摄氏度，2/3 、13/14这两对化合物共洗脱，8/9、11/12这2对化合物分离度不佳；

G2 25摄氏度，2/3 分离度较小， 6/7共洗脱；

G2 45摄氏度，2/3共洗脱、7/8/9、13/14分离度不佳；

分离风险集中在2/3、6/7/8/9、11/12、13/14；

下一步优化的方向：设计梯度应使所有化合物均在有效梯度内被洗脱，梯度应设计3水平，柱温2水平，柱温应适当升高以保证主峰的峰型良好，例如：

梯度G1 20%~75% B相20min，30摄氏度

梯度G2 20%~75% B相40min，30摄氏度

梯度G3 20%~75% B相60min，30摄氏度

梯度G1 20%~75% B相20min，50摄氏度

梯度G2 20%~75% B相40min，50摄氏度

梯度G3 20%~75% B相60min，50摄氏度

08

在进行手性分离的建模优化时，进行温度单因素的研究，单因素温度取样点为（10，20，40摄氏度），结果建模后碰到了如下图实测和预测误差大的情况，请问应该如何解决？

答：出现实测和预测误差较大的情况，可能的原因是数学模型为二次关系y=ax2+bx+c，而模型使用了一次多项式拟合，可先尝试使用二次多项式拟合y=ax2+bx+c，进行预测，如果还是差异较大，需要补充一个温度(考虑色谱柱柱温的耐受性选择合适的温度)的实验数据，以使求得的二次关系式系数a\\b\\c更准确。

09

Dwell Volume(柱前体积，梯度延迟体积) 存在差异是仪器间方法转移时经常会碰到的挑战。测量Dwell Volume的方法如下：

请描述您在进行仪器间转移时克服Dwell 差异的策略。

答：① 对于已经开发好的成熟的方法在进行仪器间隔转移时（例如药典方法的方法确认），参考欧洲药典中的公式，在梯度洗脱时先进行等度洗脱，考虑到不同仪器之间的滞留体积，开始洗脱的时间点t转换为调节时间点tc，计算公式：

tc=t-（D-D0）/F,

D为转换后仪器的滞留体积，ml

D0为方法开发时的滞留体积，ml

F：流速，ml/min

延迟体积大的仪器向延迟体积小的仪器上转移，需要增加等度部分的时间；

延迟体积小的仪器向延迟体积大的仪器上转移，需要减少等度部分的时间，但遇到延迟体积大到，即使完全去掉初始部分的等度运行时间依然达不到保留时间一致的情况，这是这种方式的弊端

（实现的方式：在方法开发初期，在正常建立梯度模型后（正常梯度模型建模时不采用增加初始等度时间），在模型上增加等度时间的考察，增加的这段等度时间需要考虑到所有可能使用到的仪器的延迟体积，保证在各种时长下关键分离对不受影响）

② 考虑到上述方式有一定的局限性，通过更改初始有机相比例的耐用性的考察来模拟不同仪器的延迟体积：

在正常建立梯度模型后，考察初始有机相比例的耐用性，目标仪器比方法开发仪器的延迟体积大，通过降低初始有机相比例进行模拟；目标仪器比方法开发仪器的延迟体积小，通过增加初始有机相比例进行模拟；观察更改初始有机相比例（至少考察±2%）后对关键分离对的影响，选择耐用性较好的平台期

③ 以上两种方式是通过色谱建模软件例如ACD进行建模实现，此外还可以通过统计学实验设计的方式：

将不同仪器的延迟体积作为因子之一，同时可将其他影响分离度的关键因素-例如梯度三要素有机相初始比例、有机相结束比例、梯度时间、流动相pH、柱温等纳入因子范围内，考察分离度与这些因子之间的数学关系，寻找分离的最佳区域，利用蒙特卡洛模拟在优化的空间内寻找方法的稳健区域，以使方法有更好的耐用性，兼顾所有仪器的延迟体积。

参考文献：Generic approach in a gradient elution HPLC method development that enables troubleshooting free method transfer《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis  207 （2021） 114367》

10

请比较Plackett -Burman 实验设计方法和传统耐用性实验方法的差异。

答：实验次数：传统耐用性实验方法通过一次实验改变1个参数one factor at a time，表中所展示的7个因子，若2水平，每个水平均考察，需要27=128次实验，PB实验只需要12次（在耐用性研究空间内，忽略因子之间的交互作用）；

具体运行实验时变量改变数目不同，传统耐用性实验单一变量，PB实验中的12次实验变动条件包含多个因子的高低两水平（PB试验设计矩阵可以随机产生，每个设计矩阵有N行，N-1列。可以每次都不一样，但都有以下三个原则：每行高水平(+)的数目为N/2个。每行低水平(-)的数目为N/2-1个。每列包含的高、低水平数相等，都为N/2个），且12次实验随机化运行以减少实验误差；

最主要的是PB耐用性实验后得到的实验结果更为丰富：通过运行12次实验后，对得到的实验结果进行方差分析，效应分析，一系列统计学相关的计算分析（使用JMP\\Minitab等统计学分析软件实现该功能），从而得到每个实验结果与研究的因子之间的数学关系，且得到显著因子，即找到对于实验结果有较大的影响的因子，从而了解在整个因子的研究空间内，实验结果所受影响的程度，从而对方法的各个参数有更深刻的认识，建立控制策略（影响结果的因子应严格控制），进而找到方法的MODR（方法的可操作区域）。