ACD/Labs AutoChrom在中控方法开发的应用

ACD/Labs

AutoChrom在

中控方法开发的应用

长沙晶易 姚倩 田草

背景介绍

目的：FCB有4个中间体，中间体1（FCB-201）、中间体2（FCB-301）、中间体3（FCB-401）和中间体4（FCB-501），工艺优化早期，各步中间体纯度较低，均小于90%，需开发相应中控方法。工艺优化过程杂质研究至关重要。考虑到检测杂质分析的便易性，尝试开发一个色谱条件检测所有中间体。同时方法需有较好的稳健性。

若要实现上述需求，方法开发难度较大。采用传统的方法开发方式，耗时很久，对人员要求较高，数据分析和整合难度较大。而ACD/Labs AutoChrom在方法开发和方法风险评估具有显著优势，故尝试采用ACD/Labs AutoChrom开发中控方法，计划缩短开发时间、增强方法稳健性和灵活性。

实验设计思路

根据AQbD原则设计实验，设计思路见下表。

关键方法参数评估

分离度公式为，分离条件对k、α、N的影响见下表。

分离条件对k、α、N的影响表

注：++主要影响；+次要影响；-相对影响很小；0没有影响

根据分离度公式和分离条件对k、α、N的影响表筛选方法关键因素，方法无需使用离子对试剂，在选定色谱柱Welch Xtimate C18（4.6*150mm，5μm）下，主要可以通过改变B种类（乙腈、甲醇等）、%B和流动相pH改善分离度。设计有机相比例、流动相pH的探索实验确定有机相比例和流动相pH条件列入建模相关实验设计的必要性和设计范围。

1.有机相种类探索实验

B种类（乙腈、甲醇）：甲醇和乙腈提供不同选择性，分别在甲醇和乙腈体系下采集各中间体的代表性谱图。

有机相乙腈和甲醇条件下FCB-201对比图

有机相乙腈和甲醇条件下FCB-301对比图

有机相乙腈和甲醇条件下FCB-401对比图

有机相乙腈和甲醇条件下FCB-501对比图

综上，对比乙腈做有机相，甲醇条件下，FCB-201、FCB-301和FLH-401中组分分离变差；FCB-401中存在高疏水性杂质，甲醇做有机相80%维持10min，存在杂质未洗脱；FCB-501中存在杂质疏水性差别大，为保证洗脱，甲醇做有机相运行时间较长，乙腈条件下，检出杂质较多，各组分保留较好。

若选择同一流动相体系，为保证各组分的分离和保留，乙腈做有机相较好，甲醇做有机相存在运行时间长、分离差问题，故有机相种类后期无需列入建模因子项，直接选择乙腈。

2.流动相pH探索实验

各化合物logD图

由各已知组分logD图，考察组分含有酸碱基团，方法流动相pH对组分保留存在影响，需作为建模因子项进行考察。对logD图分析，中间体2（ID4）含有苯胺，在pH2以下随pH减小logD值减小，中间体4（ID7）含有两个羧基基团，在pH2以上随pH增大logD值减小。考虑各组分保留，流动相pH选择pH3以下较好。为保证方法稳健性，流动相pH尽量选择在平台期，推荐流动相pH在2-3之间选择。。

流动相pH探索实验

对比pH2.1磷酸水溶液和pH6.0磷酸盐缓冲液下各中间体检出情况。

流动相pH2.1和6.0下FCB-201对比图

流动相pH2.1和6.0下FCB-301对比图

流动相pH2.1和6.0下FCB-401对比图

流动相pH2.1和6.0下FCB-501对比图

综上，对比酸性流动相pH2.1，弱酸性流动相pH6.0下，FCB-201和FCB-401保留不变，符合中性化合物保留特征。FCB-301中存在杂质保留增强，符合碱性化合物保留特征。FCB-501中大部分组分保留降低，符合酸性化合物保留特征。流动相pH对碱性化合物FCB-301和酸性化合物FCB-501中组分保留和分离存在显著影响。为保证各组分较好的保留，根据实验现象和logD分析结果，流动相pH选择2.0到3.0之间，故选择流动相pH2.0、pH2.5、pH3.0进行实验设计。

建模实验设计

梯度为方法关键条件，需列入建模因子项。通过初步探索，发现有机相25%至80%，各中间体进样，最早出峰的组分有一定保留，同时各组分均能洗脱完全，各组分保留较好。故固定初始和最终有机相比例，更改时间20min、30min、40min设置三个点进行考察。

选择乙腈做有机相，设计流动相pH和梯度两因素建模，共9个实验，设计见下两因素数据人工分析

两因素数据人工分析

· 关键方法参数评估 ·

1.FCB-201

（1）梯度的影响：同一流动相体系下，以pH2.5样本为例对比不同梯度的结果：

不同梯度条件下FCB-201溶液对比图

同一流动相体系，不同梯度下，各组分出峰顺序没有变化，显示梯度能够改变k，但对选择性a贡献较小。

（2）pH的影响：同一梯度时间，以中间梯度时间为例，对比不同流动相体系的结果：

不同流动相pH条件下FCB-201溶液对比图

同一梯度，不同流动相pH，各组分出峰位置不变，显示针对中性化合物FCB-201，流动相pH对k和选择性a无贡献。

2.FCB-301

（1）梯度的影响：同一流动相体系下，以pH2.5样本为例对比不同梯度的结果：

不同梯度条件下FCB-301溶液对比图

同一流动相体系，不同梯度下，各组分出峰顺序没有变化，显示梯度能够改变k；40min梯度主峰后有一个杂质有分离趋势，显示梯度对选择性a有一定贡献。

（2）pH的影响：同一梯度时间，以中间梯度时间为例，对比不同流动相体系的结果：

不同流动相pH条件下FCB-301供试品溶液对比图

同一梯度，不同流动相pH，FCB-301中3个杂质出峰位置不变，其他杂质随流动相pH变大，保留发生变化，主峰处杂质在不同pH下，分离情况明显不同，显示流动相pH能改变FCB-301中组分的k和选择性a。

3.FCB-401

（1）梯度的影响：同一流动相体系下，以pH2.5样本为例对比不同梯度的结果：

不同梯度条件下FCB-401供试品溶液对比图

   同一流动相体系，不同梯度下，各组分出峰顺序没有变化，显示梯度能够改变k，但对选择性a贡献较小。

（2）pH的影响：同一梯度时间，以中间梯度时间为例对比不同流动相体系的结果：

不同流动相pH条件下FCB-401供试品溶液对比图

 同一梯度，不同流动相pH，各组分出峰位置变化，显示针对中性化合物FCB-401，流动相pH对k和选择性a无贡献。

4.FCB-501

（1）梯度的影响：同一流动相体系下，以pH2.5样本为例对比不同梯度的结果：

不同梯度条件下FCB-501供试品溶液对比图

   同一流动相体系，不同梯度下，各组分出峰顺序没有变化，显示梯度能够改变k，但对选择性a共贡献较小。

（2）pH的影响：同一梯度时间，以中间梯度时间为例对比不同流动相体系的结果：

不同流动相条件下FCB-501供试品溶液对比图

 同一梯度，不同流动相pH，FCB-501中两个杂质出峰位置不变，其他杂质随流动相pH变大，保留前移，主峰前杂质在不同pH下，分离情况明显不同，显示流动相pH能改变FCB-501中组分的k和选择性a。

5.综合分析

综上，针对相同流动相体系，不同梯度，FCB-201、FCB-301、 FCB-401和FCB-501中各组分出峰位置变化。随时间延长，保留增加，但未出现出峰顺序反转情况，均为规则样品，显示出，梯度能够改变k，但对选择性a贡献较小。

针对同一梯度，不同流动相pH，中性化合物FCB-201和FCB-401中各组分出峰位置没有变化，显示流动相pH对中性化合物的k和选择性a无贡献。碱性化合物FCB-301和酸性化合物FCB-501中，部分杂质出峰位置无变化，部分杂质随流动相pH变化保留和分离情况变化，显示流动相pH能改变碱性化合物FCB-301和酸性化合物FCB-501中组分的k和选择性a。在ACD模型选择时需注意流动相pH的影响。

模型建立及重现

根据建立模型，并变动条件参数查看对应预测图变化，发现梯度对各中间体保留和分离影响较大，流动相pH对FCB-301和FCB-501保留和分离影响较大，对FCB-201和FCB-401影响较小。结合模型及筛选色谱条件，FCB-201、FCB-401、FCB-501可共方法，该方法下FCB-301中主峰与相邻杂质分离差，FCB-301可同流动相体系不同梯度程序。预测图谱和重现图谱见下。

1.FCB-201预测图及重现图

重现图

预测图谱完全重现。分离最差的为约26min的杂质，该杂质在各个条件均无法完全基线分离。该杂质含量较小，现方法下杂质之间未完全重合，能达到基本分离，故暂不考虑完全基线分离，将约26min的12不列入建模，方法耐用性好。

2.FCB-401预测图及重现图

预测图谱完全重现。分离最差的为约25min和约38min的杂质，该杂质在各个条件均无法完全基线分离，考虑杂质较多，现方法下能达到基本分离，后期工艺优化后杂质情况可能改善，若工艺确定后该杂质为必须考察杂质，可通过有机相种类、色谱柱、流动相pH等改善分离；现暂不考虑将其完全基线分离，若将约25min的杂质4和约38min的杂质10不列入建模，考察其他组分方法耐用性，方法耐用性好。

3.FCB-501预测图及重现图

预测图谱完全重现。各组分保留及分离较好。

4.FCB-301预测图及重现图

预测方法重现图

预测图谱完全重现。各组分保留及分离较好，且约20min还比建模采集时多检出两个杂质，方法识别能力高。

本季度工作总结与概述

所有中间体共流动相体系，方便检测；各组分中较大杂质均能达到分离，3个中间体共方法，优化过程中便于杂质追踪分析；基于风险的策略和二维分离度图，选择稳健性高的方法；最终方法符合预期目标。建模数据留档建立知识空间，后期杂质变化，可先在软件调整杂质是否列入建模，从而预测可能图谱，并可根据考察杂质变化、方法目标变化优化方法条件。

总结分析

（1）人效：ACD软件在复杂和难度较大的方法开发有巨大的贡献，计算本次开发人员花费时间：

a、中控检测时配制流动相晚上设置序列同步完成探索实验，人员花费（0.5d）；

b、配制流动相和进样溶液，设置色谱条件采集（1d）；

c、按设计采集数据（3d）,此时人员仅需确保正常采集，可同步进行其他工作，人员0d；

d、数据分析，数据导入软件积分,并进行色谱条件输入（1d）;

e、数据分析并选择条件（0.5d）。

整体人员花费3d即可开发出难度如此大的4个方法，大大提高人效。

（2）人员资质需求：难度大的方法开发往往对实验人员能力有一定要求，但实验设计让很多初次进行开发实验的人员也可快速完成难度大的方法开发。

（3）方法稳健性：采用传统试错方式开发出来的方法，有时无法很好评估方法的稳健性，在运行中可能出现重现性问题，而ACD建立预测图谱和方法参数关系，变动条件可直观看到各组分保留和分离的变化，很好评估方法的耐用性。并选择耐用性较好的色谱条件，掌握方法风险。

（4）知识空间储备：将模型储备在电脑，后期随着工艺的变化，样品情况和杂质可能变化。且往往是信息增加，工艺越好，中间体杂质情况越来越好。后期考察杂质减少后，可在模型中将减少的杂质不列入建模，重新预测可能图谱。也可根据目标缩短运行时间等，这些均无需再次方法开发，根据后期样品情况评估适用的方法条件，仅需将适用条件进行重现。

总而言之，这次小的尝试让我感受到了实验设计的魅力，ACD的魅力。它让我们的工作简单而有趣。希望可以有更多的尝试和应用。

ACD/Labs CN

微信号｜ACDLabsCN