看到上一期的“陷阱”专题大家这么喜欢,小编ABI我这颗玻璃心总算保住啦~
当然,不能光我一个劲儿的跟大家说啊,作为一个心地善良、美丽又大方的骚年~
倾听、解答是我的必备技能啊!
所以一不做二不休,小编ABI再奉上诚意干货大礼!
话不多说,上菜!
PCR结果只有熔解曲线,无扩增曲线,这是为什么?
可能是由于在PCR循环步骤没有设置采集荧光的步骤,而熔解曲线默认采集荧光,所以只有熔解曲线,没有扩增曲线。
(在set up的run methods里如果把40个扩增时60度1分钟下面的小方框单击可以去掉,这个时候就不会采集荧光信号了,且按理说后面的溶解曲线也是没有的,只能在multiple component那里看到图)
可以这样设置,但实验结果可能会有偏差。
如果熔解曲线出现双峰,证明扩增产物中有两种产物,或者为引物二聚体。或者为非特异性产物。可以重新设计引物,或者优化PCR反应条件。
重复性不好的原因很多,大部分是因为加样不准确造成的。
可能原因为基线终止循环设置不正确,可以手动设置基线,重新分析即可。
(在analysis选项里,可以将基线的auto设置前的勾去掉,则可以对基线进行手动设置,拉动x轴下方的小三角形,往ct值大的方向拉动,重新analysis,然后选择线性图,可以看到扩增曲线会变形。或者可以在analysis settings中手动修改基线的起始和终止循环)
1、 标准品浓度太低,即使是最高浓度标准品Ct值也大于25接近30,低浓度的DNA样品保存时间较长会有降解现象出现。因此建议将标准品浓缩。
2、 标准品倍比稀释2倍稀释造成稀释不好,建议10倍倍比稀释,且采用逐步倍比稀释的办法,比如将10v的高浓度标准品a加入90v的水中得到10倍稀释后的标准品b,彻底混匀之后再吸取10v的b加入90v的水中......
探针质量不好比如部分降解会干扰基线且使得PCR效率不高,试剂质量不好也会出现PCR效率不高等问题,这些问题都会使得扩增曲线异常,而不是标准的s形
需要通过添加customer dye,对HEX进行校正。(HEX不是ABI进行过校准的荧光,所以客户使用这类荧光标记探针时,必须使用纯的荧光(即customer dye)运行一次进行校正)
做一次清洗之后做背景校正,然后再用标准品做一次试验,如有上述现象,工程师要测量仪器的孔间温度
先开电脑,之后开主机,再开软件
建议选择FAM、VIC、NED标记。
呼~一口气回答了这么多问题,不要拦我,我要去小憩一下……不!小编我要用最后一丝气力跟大家科普一下:
今天是世界卫生组织确定的第五个“世界肝炎日”,宣传主题是:战胜肝炎,从我做起。我国国家卫生计生委将“世界肝炎日”主题确定为“抗击肝炎,预防先行”,副标题为“疫苗接种好,铸就健康路”。赛默飞呼吁大家做好疫苗接种,防止从我做起。
各位亲们也可以好好消化一下。小编ABI与你下次再约!
回复【Q3Q5】,获取Q3Q5产品资讯等信息。
回复【3D】,获取QuantStudio®3D数字PCR产品资讯及最新新闻。
回复【ABI故事】,获取最新ABI技术发展信息。