TaqTalk 27期 | 如何将实时荧光PCR的cDNA浓度归一化？

每当进行基因表达实验时，我们至少需要两种基因特异性检测，一种用于我们感兴趣的基因，另一种用于内源性对照基因（也称为归一化基因或管家基因）。不同的术语表达同样的意思。那么内源性对照对我们有什么作用呢？从本质上讲，其首要任务是归一化我们的数据，以解决添加的模板数量的差异。比如说，我正在使用两个样本来比较我感兴趣的基因表达，一个未经处理，另一个取自处理过的细胞系。

当我检查实时荧光PCR结果时，发现两个样品的阈值循环数相差一个Ct。这表明样品的目标表达水平之间存在两倍的差异。但是我怎么知道这两倍差异是真实的呢？毕竟未经处理和经过处理的样品可能含有不同浓度的cDNA，这就是我们看到相差一个Ct的原因。这种可能性一定存在，因此我们必须对每个样品运行内源性对照。

假设起始量相同，一个好的管家基因能在各种样本类型中稳定表达。多亏从内源性对照检测中收集的数据，我可以有效地监测cDNA输入量，即使它因样品而异。在运行结束时，可以用内源性对照的Ct数据来校正最终表达值，并解释不同数量的cDNA输入。因此，可以不必总在运行实验时添加等量模板。

但我们的样品必须始终确保清晰表达，对照品才能正确完成其工作。否则对照数据实际上会使最终表达值的准确性降低。那么如何选择良好的内源性对照品呢？这是个好问题。我们将在近期的Taq Talk中进行深入探究，敬请期待。