上回提到了定量PCR的基础概念和比较常见的异常分析，今天我们来深入讨论一下常见的影响因素及异常曲线形态。
引起结果曲线异常的原因，总结起来有以下几项：
1. 耗材
2. 试剂
3. 操作
4. 仪器性能
具体来讲
1. 耗材及配件
1) 有些常见的定量PCR需要使用特定型号的96孔板或者特定体积的PCR八连管，如果使用了非配套的耗材，可能会导致热盖无法压紧、甚至损坏仪器。
2) 普通PCR管的盖子比较厚，会影响荧光信号采集效率，因此推荐定量PCR专用的PCR八连管
3) 使用了质量比较差的耗材。某些质量不好的耗材，自身会带有荧光物质，这会影响仪器采集到的信号强度，导致反应孔的自动基线扣除错误，得到不准确的CT值。另外，耗材批次间的稳定性同样也会影响数据的稳定性。
4) 最后，还要注意96孔板封板膜要严格密封，避免体系蒸发影响扩增。如果扩增曲线为斜直线（如下图），大概率是密封性的原因。
2. 试剂
做定量PCR使用探针法和染料法，以及商品化的master mix，要注意的是试剂不可反复冻融，探针和染料要避光保存，可以通过试剂盒中附带的阳性样品来判断试剂的有效性。如果选择自行设计探针，一定要选择合成稳定性高、标记效率高的服务公司，否则合成的探针可能会存在不稳定现象，在使用过程中发生降解，影响检测效果。下图是探针降解的异常曲线。同样，PCR体系中含有扩增抑制物、模板浓度过高时，也会出现类似斜线型扩增曲线。
3. 实验操作
在加样的时候，移液器枪尖中有液体残留，是导致结果重复性不佳的重要原因之一。冷冻融化试剂使用前是否有混匀，如果没有混匀，这时候取出的试剂不是均一的，也会影响后面的扩增效率的均一性；反应体系里尽量不要有大的气泡，有气泡的话，中间容易形成折射，干扰荧光的采集，在上机前最好要通过离心来去除气泡，并将管壁上的液体集中到管底。还需要注意的是，加样过程中要注意避免污染，如果阴性样品在扩增曲线末尾起跳但是信号较弱，有可能是扩增体系发生污染。
4. 仪器
最后呢，才是考虑仪器性能问题，目前市面上仪器出问题的概率相对比较低。在多方排除后，再考虑是否需要对仪器进行校准或维修。
值得一提的是，仪器的性能确实会给结果带来一定的影响。比如温控的准确性、均一性、升降温速率以及光源的配置。具体会产生什么影响呢？听小编细细道来。
众所周知PCR过程就是一个不断变温的过程，在不断的解旋、退火、延伸过程中，酶和引物结合到模板上开启延伸过程。控温做的越准，越快的达到指定温度，酶和引物错配的概率越低，从而保证了扩增的准确性。光源的种类也很重要，我们知道染料的激发波长范围呈正态分布，一般采用的FAM探针最佳激发波长约为498nm，如果采用单一光源进行激发，其波长可能无法有效覆盖、完全激发FAM探针，造成CT值的滞后。
影响定量PCR实验结果的因素有很多，大家在遇到异常曲线的时候，要从这四个方面逐个去排查，切记不要单方面认为仪器或试剂有问题。
在此，向大家介绍一款高性能的荧光定量PCR—qTOWER3G，来源于德国卡尔蔡司的光学部门，凭借优异的温控水平及光学元件，结合纯银镀金的样品槽，真正做到了均一性±0.15℃，准确性±0.1℃，最大升温速率8℃/s，尽可能保证更佳产物的重复性。另外，仪器配置白、红、绿、蓝四色高能LED光源，全可见光谱范围激发，染料激发效率更高，助力检测更低丰度的基因表达。
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