水产品中硝呋索尔、硝基呋喃代谢物残留量测定的解决方案（二）--GB****征求意见稿

（图片源自摄图网）

硝基呋喃类药物（nitrofurans）广泛用于家禽、家畜、水产、蜂等动物传染病的预防与治疗，常见的硝基呋喃药物包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因，硝呋索尔也是一种硝基呋喃类抗菌药物，其结构和性质与呋喃唑酮等其它硝基呋喃类药物相似，原药在动物组织中代谢快速，生成代谢产物 3，5-二硝基水杨酸肼(3，5-Dinitrosalicylic acid hydrazide，DNSAH)和 5-硝基-2-糠酸，此类代谢产物在动物体内能与蛋白紧密结合，形成稳定的结合态残留物，可在体内存在相当长时间，具有一定的毒性。

根据欧盟 (EU ) 2019/1871 法规要求，自2022年11月28日起，动物源性食品需符合硝基呋喃代谢物 (增加硝呋索尔代谢物，共5种) 测定限值 0.5μg/kg的要求。海关总署也发函要求输欧盟养殖水产品、禽肉制品、蜂产品等动物源食品要批批检测硝基呋喃（含硝呋索尔）。

安谱实验参照《食品安全国家标准 水产品中硝呋索尔代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》征求意见稿，对方法进行适当优化，提供同时检测水产品中硝呋索尔、硝基呋喃代谢物残留量的完整应用解决方案。

一

标准溶液配制

1

标准品

硝呋索尔代谢物3,5-二硝基水杨酸肼(DNSAH)，CDAA-S-300176-XA-1ml，100 mg/L于甲醇/水；

硝呋索尔代谢物内标3,5-二硝基水杨酸肼-15N2 (DNSAH-15N2)，10 mg/L于甲醇，CDAA-S-300176N2-AL-1.2ml；

4种硝基呋喃类代谢物混标，CDAA-M-520005-AB-1ml，100 mg/L于甲醇；

4种硝基呋喃类代谢物内标混标，CDAA-M-520006-AA-1ml，100 mg/L于甲醇；

表1-1硝呋索尔、4种硝基呋喃类代谢物及内标基本信息

二

前处理操作

1

样品前处理

基质样品：鱼、虾

水解和衍生化：

取试料2g（精确±0.01g），于50mL离心管中，准确加入50 μL 4种硝基呋喃类代谢物内标工作液（0.1 µg/mL）和100 μL DNSAH内标工作液（0.1 µg/mL），涡旋混合1min，加0.5 mol/L盐酸溶液5 mL、0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液0.15mL，涡旋混合1min，置于恒温振荡器中，37 ℃避光振荡16h。

提取和净化：

用磷酸氢二钾溶液调 pH 至7.0 -7.5，加乙酸乙酯8mL，涡旋振荡10min，于4 ℃下10000 r/min 离心10min，取上清液至10mL玻璃离心管，40 ℃氮气吹干。加1.0mL定溶液（氨水乙腈溶液：移取35μL氨水，用10%乙腈水溶液稀释并定容至100 mL）溶解残留物，复溶液转移至15mL离心管中，4 ℃下13000r/min离心5min，过0.22µm PTFE滤器，待测。

注意事项

1、提取步骤离心条件改为在4℃，10 000 r/min离心10 min；

2、样品复溶除脂后若仍较浑浊，可低温冷冻后再离心过PTFE滤膜或使用超滤离心管；

3、过0.22μm PTFE针式滤器时建议过滤速度慢一些，只收集中间流出液200μL左右即可，使用内衬管上机进样，残留1/3左右的溶液在注射器中，这样可以保证样品相对清澈，如果全部过滤完则可能导致溶液浑浊。

4、硝呋索尔和4种硝基呋喃混标同时加标检测，最终复溶液为氨水乙腈溶液。

2

样品加标

①加标水平 0.5 μg/kg（对应上机溶液浓度 1 ng/mL）：称取样品后，分别加入0.1 mL 0.01 μg/mL DNSAH标准工作液Ⅱ和0.01 μg/mL 4种硝基呋喃类代谢物标准工作液Ⅱ，后续操作同上；鱼肉基质和虾肉基质各2个平行样；

②加标水平 1.0 μg/kg（对应上机溶液浓度 2 ng/mL）：称取样品后，分别加入0.2 mL 0.01 μg/mL DNSAH标准工作液Ⅱ和0.01 μg/mL 4种硝基呋喃类代谢物标准工作液Ⅱ，后续操作同上；鱼肉基质和虾肉基质各2个平行样；

③加标水平 5 μg/kg（对应上机溶液浓度 10 ng/mL）：称取样品后，分别加入0.1 mL 0.1 μg/mL DNSAH标准工作液Ⅰ和0.1 μg/mL 4种硝基呋喃类代谢物标准工作液Ⅰ，后续操作同上；鱼肉基质和虾肉基质各2个平行样。

3

标准曲线

分别吸取0.01 µg/mL DNSAH 标准工作液和4种硝基呋喃类代谢物标准工作液各0.05mL、0.1mL、0.2 mL，0.1µg/mL 的 DNSAH 标准工作液和4种硝基呋喃类代谢物标准工作液各0.05mL、0.1mL于50 mL 离心管中，除不加基质样品外，其他操作同样品，得到浓度为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、和10ng/mL的标准品。

三

仪器条件

1

液相色谱

a) Athena C18-WP 液相色谱柱（2.1mm*100mm，3μm，货号：LAEQ-211073）；

b)柱温：30℃

c)流速：0.35mL/min

d)进样量：10 µL；

f)流动相：A：甲醇，B：2mmol/L乙酸铵溶液；

表3-1 液相色谱梯度洗脱条件

2

质谱条件-硝呋索尔

a）离子源喷雾电压（IS）：-4500 V；

b）雾化温度（TEM）：500℃；

c）气帘气压力（CUR）：30 psi；

d）雾化气压力（GAS1）：60psi；

e）加热辅助气（GAS2）：65psi；

f）碰撞气流速比（CAD）：8；

g) 其他参数见表3-2。

表3-2 硝呋索尔及其内标代谢物特征离子参考质谱条件

3

质谱条件-硝基呋喃

a）离子源喷雾电压（IS）：4500 V；

b）雾化温度（TEM）：550℃；

c）气帘气压力（CUR）：30 psi；

d）雾化气压力（GAS1）：60psi；

e）加热辅助气（GAS2）：65psi；

f）碰撞气流速比（CAD）：8；

g）其他参数参见表3-3。

表3-3 硝基呋喃类代谢物特征离子参考质谱条件

四

实验谱图

1

硝呋索尔实验谱图

图4-1 混合标准溶液谱图

（目标物及同位素内标浓度10ng/mL）

图4-2 鱼肉基质样品谱图

图4-3 鱼肉加标样品谱图（加标水平10ng/mL）

图4-4 虾肉基质样品谱图

图4-5 虾肉加标样品谱图（加标水平10ng/mL）

2

硝基呋喃实验谱图

AOZ

AOZ-D₄

AMOZ

AMOZ-D₅

AHD

 AHD-¹³C₃

SEM

SEM-¹³C,¹⁵N₂

图4-6 混合标准溶液谱图（目标物及同位素内标浓度10ng/mL）

AOZ

AOZ-D₄

AMOZ

 AMOZ-D₅

AHD

AHD-¹³C₃

SEM

SEM-¹³C,¹⁵N₂

图4-7 鱼肉基质样品谱图

AOZ

AOZ-D₄

AMOZ

AMOZ-D₅

AHD

AHD-¹³C₃

SEM

SEM-¹³C,¹⁵N₂

图4-8 鱼肉基质加标样品谱图（加标水平10ng/mL）

AOZ

AOZ-D₄

AMOZ

AMOZ-D₅

AHD

AHD-¹³C₃

SEM

SEM-¹³C,¹⁵N₂

图4-9 虾肉基质样品谱图

AOZ

AOZ-D₄

AMOZ

AMOZ-D₅

AHD

AHD-¹³C₃

SEM

SEM-¹³C,¹⁵N₂

图4-10 虾肉基质加标样品谱图（加标水平10ng/mL）

五

实验数据

1

标准曲线

表5-1  硝呋索尔及4种硝基呋喃代谢物标准曲线

2

加标回收率数据

表5-2  鱼肉基质加标回收率数据

表5-3  虾肉基质加标回收率数据

六

实验结论

优化后的方法，硝呋索尔及4种硝基呋喃代谢物标准曲线线性方程R2 > 0.995，线性良好。鱼肉、虾肉基质3个加标水平加标回收率在80%-120%之间，加标回收率良好。能够满足实验要求。

六

实验耗材

上期回顾

水产品中硝呋索尔、硝基呋喃代谢物残留量测定的解决方案（一）——SN/T 4520-2016

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