硝基呋喃类药物
（图片源自摄图网）
硝基呋喃类药物（nitrofurans）广泛用于家禽、家畜、水产、蜂等动物传染病的预防与治疗，常见的硝基呋喃药物包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因，硝呋索尔也是一种硝基呋喃类抗菌药物，其结构和性质与呋喃唑酮等其它硝基呋喃类药物相似，原药在动物组织中代谢快速，生成代谢产物 3，5-二硝基水杨酸肼(3，5-Dinitrosalicylic acid hydrazide，DNSAH)和 5-硝基-2-糠酸，此类代谢产物在动物体内能与蛋白紧密结合，形成稳定的结合态残留物，可在体内存在相当长时间，具有一定的毒性。
根据欧盟 (EU ) 2019/1871 法规要求，自2022年11月28日起，动物源性食品需符合硝基呋喃代谢物 (增加硝呋索尔代谢物，共5种) 测定限值 0.5μg/kg的要求。海关总署也发函要求输欧盟养殖水产品、禽肉制品、蜂产品等动物源食品要批批检测硝基呋喃（含硝呋索尔）。安谱实验参照《SN/T 4520-2016 出口动物源食品中硝呋索尔代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》，对方法进行适当优化，提供同时检测水产品中硝呋索尔、硝基呋喃代谢物残留量的完整应用解决方案。
一、标准溶液配制
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标准品
硝呋索尔代谢物3,5-二硝基水杨酸肼(DNSAH)，CDAA-S-300176-XA-1ml，100 mg/L于甲醇/水；
硝呋索尔代谢物内标3,5-二硝基水杨酸肼-15N2 (DNSAH-15N2)，10 mg/L于甲醇, CDAA-S-300176N2-AL-1.2ml；
4种硝基呋喃类代谢物混标，CDAA-M-520005-AB-1ml，100 mg/L于甲醇；
4种硝基呋喃类代谢物内标混标，CDAA-M-520006-AA-1ml，100 mg/L于甲醇。
表1-1硝呋索尔、4种硝基呋喃类代谢物及内标基本信息
二、前处理操作
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样品前处理
基质样品：鱼、虾
水解和衍生化：
称取约2.00 g均匀试样（精确到0.01g）于50 mL塑料离心管中，加入0.1 mL DNSAH 内标工作液（0.1 µg/mL）、0.05 mL4种硝基呋喃类代谢物内标工作液（0.1 µg/mL），再依次加入10 mL水，0.5 mL 1 mol/L 盐酸溶液和500 μL 0.05mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，涡旋混匀后置于37℃恒温振荡器中避光反应16 h。
提取和净化：
衍生后试样冷却至室温，加5 mL 0.1mol/L磷酸氢二钠溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.0~7.5后，再加2.0g中性氧化铝（货号SBEQ-CA1801），摇匀1 min，在4℃，10 000 r/min离心10 min，上层清液转移至装有16 mL乙酸乙酯的50mL塑料离心管（铝箔纸避光）中，多管漩涡混合仪漩涡10min后，在4℃条件下，10 000 r/ min离心5 min，收集乙酸乙酯层，残留物用10 mL乙酸乙酯再提取一次，合并两次乙酸乙酯提取液。
提取液在40°C下氮吹干，残渣用1 mL定容液（2mmol/L乙酸铵溶液：乙腈=8：2）溶解，复溶后溶液转移至15mL离心管，再用2 mL乙腈饱和的正己烷液液萃取净化去脂。除去上层溶液后于4℃，13 000 r/min下离心5 min，使用玻璃巴斯德吸管小心吸取下层溶液过0.22 μm PTFE滤膜，待测。
注意事项
1、提取步骤离心条件改为在4℃，10 000 r/min离心10 min；
2、样品复溶除脂后若仍较浑浊，可低温冷冻后再离心过PTFE滤膜或使用超滤离心管；
3、过0.22μm PTFE针式滤器时建议过滤速度慢一些，只收集中间流出液200μL左右即可，使用内衬管上机进样，残留1/3左右的溶液在注射器中，这样可以保证样品相对清澈，如果全部过滤完则可能导致溶液浑浊。
4、硝呋索尔和4种硝基呋喃混标同时加标检测，最终复溶液为乙酸铵溶液：乙腈溶液。
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样品加标
① 加标水平 0.5 μg/kg（对应上机溶液浓度 1 ng/mL）：称取样品后，分别加入0.1 mL 0.01 μg/mL DNSAH标准工作液Ⅱ和0.01 μg/mL 4种硝基呋喃类代谢物标准工作液Ⅱ，后续操作同上；鱼肉基质和虾肉基质各2个平行样；
② 加标水平 1.0 μg/kg（对应上机溶液浓度 2 ng/mL）：称取样品后，分别加入0.2 mL 0.01 μg/mL DNSAH标准工作液Ⅱ和0.01 μg/mL 4种硝基呋喃类代谢物标准工作液Ⅱ，后续操作同上；鱼肉基质和虾肉基质各2个平行样；
③ 加标水平 5 μg/kg（对应上机溶液浓度 10 ng/mL）：称取样品后，分别加入0.1 mL 0.1 μg/mL DNSAH标准工作液Ⅰ和0.1 μg/mL 4种硝基呋喃类代谢物标准工作液Ⅰ，后续操作同上；鱼肉基质和虾肉基质各2个平行样。
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标准曲线
分别吸取0.01 µg/mL DNSAH 标准工作液和4种硝基呋喃类代谢物标准工作液各0.05 mL、0.1mL、0.2 mL，0.1 µg/mL 的 DNSAH 标准工作液和4种硝基呋喃类代谢物标准工作液各0.05 mL、0.1 mL于50 mL 离心管中，除不加基质样品外，其他操作同样品，得到浓度为0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、和10ng/mL的标准品
三、仪器条件
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液相色谱条件
a) Athena C18-WP 液相色谱柱（2.1mm*100mm，3μm，货号：LAEQ-211073）；
b)柱温：30℃
c)流速：0.35mL/min
d)进样量：10 µL；
f)流动相：A：甲醇，B：2mmol/L乙酸铵溶液；
表3-1 液相色谱梯度洗脱条件
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质谱条件-硝呋索尔
a）离子源喷雾电压（IS）：-4500 V；
b）雾化温度（TEM）：500℃；
c）气帘气压力（CUR）：30 psi；
d）雾化气压力（GAS1）：60psi；
e）加热辅助气（GAS2）：65psi；
f）碰撞气流速比（CAD）：8；
g) 其他参数见表3-2。
表3-2 硝呋索尔及其内标代谢物特征离子参考质谱条件
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质谱条件-硝基呋喃
a）离子源喷雾电压（IS）：4500 V；
b）雾化温度（TEM）：550℃；
c）气帘气压力（CUR）：30 psi；
d）雾化气压力（GAS1）：60psi；
e）加热辅助气（GAS2）：65psi；
f）碰撞气流速比（CAD）：8；
g）其他参数参见表3-3。
表3-3 硝基呋喃类代谢物特征离子参考质谱条件
四、实验谱图
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硝呋索尔实验谱图
图4-1 混合标准溶液谱图
（目标物及同位素内标浓度10ng/mL）
图4-2 鱼肉基质样品谱图
图4-3 鱼肉加标样品谱图（加标水平10ng/mL）
图4-4 虾肉基质样品谱图
图4-5 虾肉加标样品谱图（加标水平10ng/mL）
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硝基呋喃实验谱图
图4-6 混合标准溶液谱图
（目标物浓度10ng/mL及同位素内标）
图4-7 鱼肉基质样品谱图
图4-8 鱼肉基质加标样品谱图（加标水平10ng/mL）
图4-9 虾肉基质样品谱图
图4-10 虾肉基质加标样品谱图（加标水平10ng/mL）
五、实验数据
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标准曲线
表5-1 硝呋索尔及4种硝基呋喃代谢物标准曲线
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加标回收率数据
表5-2 鱼肉基质加标回收率数据
表5-3 虾肉基质加标回收率数据
六、实验结论
优化后的方法，硝呋索尔及4种硝基呋喃代谢物标准曲线线性方程R2 > 0.995，线性良好。鱼肉、虾肉基质3个加标水平加标回收率在80%-120%之间，加标回收率良好。能够满足实验要求。
七、实验耗材
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热线电话｜400-863-0099
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