在前2篇推文中,我们总结了5类主要的circRNA功能和6大circRNA研究方法,接下来我们重点讨论下circRNA的形成机制。
线性RNA前体合成
1
化学合成
优势:RNA合成纯度高,方便定制化序列;
局限性:适用于长度在70-80bp的小片段RNA合成
2
体外转录IVT
优势:适用于长片段(~kb)的RNA合成;
局限性:由T7、T3或SP6 RNA聚合酶转录的线性RNA3’起始端第1个碱基通常需要是鸟苷酸G,5’末端通常会添加1-3个碱基的非模板序列;
解决方法:i) 将丁型肝炎病毒核酶序列(~67 个核苷酸长)附加到 DNA 模板的末端,这导致转录后在 3'' 末端进行精确的核酶切割,ii) 使用含有 2'' -O- 的 PCR 模板 其 3'' 端的甲基核苷酸,减少了 T7 的非模板核苷酸添加。
赛默飞提供大规模体外转录MEGAscript T7 转录试剂盒(200或40次反应),该试剂盒 (货号AMB13345和AM1334) 有以下特点:
单反应RNA产量可达100ug
试剂盒可一次性提供200次反应
超过30年的经典选择
RNA环化连接
1
化学法
缩合试剂溴化氰 (BrCN) 或 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺 (EDC) 常用于化学激活 的RNA 环化。
局限性:环化键不是磷酸二酯键,因此无法在化学上模拟体内的反向剪接位点。
2
连接酶
体外 RNA 的酶促分子内连接需要 RNA 在其 5'' 端包含单磷酸基团。这可以通过在 IVT 反应期间调节GMP 与 GTP 摩尔比或使用焦磷酸酶去磷酸化来实现。可以使用 T4 DNA 连接酶、T4 RNA 连接酶 1 或 T4 RNA 连接酶 2 实现单磷酸化 RNA 的酶促连接。赛默飞提供 T4 RNA 连接酶(货号AM2141或EL0021)的产品供大家选择。
局限性:连接酶法序列依赖性强,适用于环化较短的 circRNA(最多约 300 个核苷酸)。
3
核酶
核酶是具有类似蛋白质酶典型催化作用的 RNA。使用某些核酶序列形成了体外环化 circRNA 的第3种策略。目前最常用于环化RNA的核酶包括在细菌和真核生物的 rRNA、tRNA 和 mRNA 基因中自然发现的 Group I/II内含子。
优势:适用于长片段RNA环化(最多几千个碱基),序列依赖性弱,环化效率高,不需要额外的酶。特别的,Group II内含子核酶促进的环化可以实现体外转录共环化,RNA无残留序列。
总结
今天这篇文章重点介绍了circRNA的形成机制,下期我们将分享circRNA应用的高分文献,各位看官下期再会!
Invitrogen™ MEGAscript T7 转录试剂盒
(200次反应,货号AMB13345)
Invitrogen™ MEGAscript T7 转录试剂盒
(40次反应,货号AM1334)
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参考文献:
Obi P, Chen YG. The design and synthesis of circular RNAs. Methods. 2021 Dec;196:85-103. doi: 10.1016/j.ymeth.2021.02.020. Epub 2021 Mar 2. PMID: 33662562; PMCID: PMC8670866.
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