权威验证系列(二) 湖北省药检院使用Panta对人纤维蛋白原质品进行快速质量控制

NanoTemper

2023.5.24

作者诺坦普

TA的动态

前言

*图片来源于湖北药检所官网

人纤维蛋白原(human fibrinogen, Fg)是一种由肝脏合成的球蛋白，发挥止血和凝血功能。Fg可用于治疗先天性和获得性Fg缺乏症患者的凝血功能障碍。目前Fg制剂是由健康人血浆经分离、提纯并经病毒去除和灭活处理、冻干制成。

Fg这类蛋白质药物具有大分子、多电荷、结构复杂等特点，其稳定性往往较差。而稳定性是保证药物发挥其作用的基础。2023年3月，湖北省药品监督检验研究院王文晞博士近期发表“多功能蛋白质稳定性分析仪在人纤维蛋白原制品质量控制中的应用”，借助NanoTemper公司的PR Panta对不同企业生产的Fg产品的质量进行快速分析质控。

NanoTemper用户应用案例解读

检测样品

全国７家企业的21批样品

使用仪器

PR Panta多功能蛋白稳定性分析仪

涉及技术&DOI

nanoDSF技术

DLS（动态光散射）

Backreflection（背反射）

DOI: 10.3870/j.issn.1004-0781.2023.03.0190

/ 实验步骤/

NanoTemper多功能蛋白质稳定性分析仪PR Panta可用于快速测定蛋白质的热稳定性，通过热变性、粒径分布聚集倾向和粒径大小等参数对产品进行评估。

使用毛细管吸取10uL 20mg/ml样品置于PR Panta上，首先在DLS模块上检测Fg的水力学半径（Rh），然后进行1℃/min的升温（25℃-95 ℃）。使用1份样品，同时且实时的检测获得Fg的样品热变性中点温度（Ｔｍ）、蛋白质初始去折叠温度(Tonset)、粒径开始变化温度(Tsize)和流体力学半径(Rh)等多种参数。

/ 研究结果/

nanoDSF检测模块结果显示21批次样品Tｍ值为51.20~53.31 ℃(表1)。不同企业产品Tｍ值存在一定差异，最高相差 2.1 ℃，表明各企业间产品稳定性存在较大差异。其中企业Ｆ产品Tｍ值最高（53.28℃），企业Ａ产品Tｍ值最低（51.22℃），差别2.06℃。

表１不同企业Fg蛋白热变性中点温度Ｔｍ值测定结果

21批次样品的Tonset值为47.29~49.32 ℃（表2），不同企业产品Tonset值存在一定差异。其中企业Ｆ的产品Tonset值最高，企业A Tonset值最低，总体与Ｔｍ值趋势一致。

表２不同企业Fg蛋白质初始去折叠温度Tonset值测定结果

21批次样品Tsize值45.36~46.99 ℃，不同企业产品Tsize值差异较小。

表３不同企业Fg蛋白粒径开始变化温度Tsize值结果

21批次样品Rh值 19.03~30.75 nｍ，不同企业产品Rh值存在一定差异。

表４不同企业Fg蛋白流体力学半径 Rh 值结果

综上可知企业Ｆ产品热稳定性最好，企业Ａ产品热稳定最差。

除稳定性外，纯度是反映Fg产品中可凝固蛋白与总蛋白的比值是产品有效性的重要指标。作者通过凯氏定氮仪进行样品检测后并依据下方公式计算纯度。

结果显示21批次样品纯度80.3%~95.9%（表5），其中企业Ｆ产品纯度最高，平均94.6%。企业Ａ产品纯度最低平均83.2%。

表5 Fg纯度测定结果

作者将纯度与在PR Panta检测得到的Tｍ值进行相关性分析，结果显示相关系数为0.729,Ｐ＜0.05 。即产品纯度与Tｍ值呈显著相关, 热稳定性高的产品纯度较高。

为了明确Fg的组分分布，作者采用HPSEC-MALLS测定纯度最高与最低产品的组分分布。

企业Ｆ产品（稳定性&纯度最佳）由Fg单体和多聚物２个组分组成，企业Ａ产品（稳定性&纯度最佳最差）由 Fg单体、多聚物和蛋白质降解产物３个组分组成。

结合以上部分稳定性与纯度呈相关性的结果可以进一步分析得出，Fg热稳定性较差，在生产、存放、复溶后放置的过程中会形成可溶性寡聚体，导致产品纯度降低。因此可根据产品热稳定性测定结果初步分析不同企业产品纯度高低，进而能简单、快速地对不同企业间产品质量进行初步评估，为企业工艺优化和制剂筛选提供更加快速、准确的依据。

多功能蛋白质稳定性分析仪可以测定产品纯度与稳定性，为人纤维蛋白原产品保护剂的筛选和生产工艺优化提供相应数据参考，且能对不同企业产品的质量进行初步分析，仪器操作简便、检测时间短、检测效率高。

——摘自本文文献对PR Panta的评价