【干货】教你轻松拿捏基因定位&克隆

TIANGEN

2023.6.20

一年一度的毕业季如约而至，想必各位小伙伴在挥泪告别实验室的师兄师姐之后，又要转身独自面对科研中一个又一个的“烫手山芋”。Don‘t worry，在新学期开始前，我们将陆续帮大家梳理植物研究的思路，今天先从基因定位与候选基因的克隆聊起。

提到 基因定位，正向遗传学一定是做植物研究的小伙伴躲不过的一道坎，我们通常会从感兴趣的表型入手，对控制目标性状的基因进行遗传定位，最终结合多种生物学手段来解析背后蕴藏着的分子机制。一般来说，涉及到的目标基因（位点）根据来源大致可分为：一种是自然变异产生的突变位点，通常存在于一些家系品种或是自然收集的材料中；另一种则是经过人工诱变创制得到的突变体材料。无论是数量性状位点定位还是突变体基因的克隆，背后的遗传学基础都离不开“基因—表型”之间的一一对应关系。

如果把基因定位比喻成千里寻人，首先要做的就是确定目标（基因）所在的"城市"（染色体），之后可以根据与目标同频出现次数（遗传距离）的由低到至高，逐步缩小定位区间，当大家在依次确认了目标所在的"学校-院系-专业-班级-宿舍"之后，就基本上可以结合候选基因的序列变异情况来判断最终的人选（候选基因）。整个过程中最关键的其实就是挖掘与目标性状保持共分离的分子标记（可根据重组单株数量判定）。

因此，基因型信息无疑是直接决定目标基因定位准确与否的关键要素之一。常见的用于基因分型的分子标记有很多，包括早期的RFLP、CAPS、SSR标记，以及近些年广泛应用的Indel和SNP标记。经典的SSR标记和Indel标记可以通过PCR扩增-电泳的方式用以区分个体基因型，值得注意的是需要查看所用标记是否为共显性标记，即可根据扩增带型差异区分显性纯和，杂合和隐形纯和的基因型。

事实上在精细定位某个基因的最后过程里，容易碰到的一个困境就是筛选不到具有多态性的分子标记，这个时候可以试着从SNP位点入手，根据区间内不同的SNP位点来确定具体的基因型。TIANGEN推出的HRM分析试剂盒（EvaGreen）（目录号：FP210），十分适合针对多种类型SNP位点的基因分型。

高分辨率：采用 EvaGreen 饱和染料，在饱和状态下具很高的熔解曲线分辨率，可以区分单个碱基的变异。
高特异性：采用抗体修饰的热启动 DNA 聚合酶，降低非特异性扩增，提高特异性。
高稳定性：精心优化 Buffer 体系，增加了熔解曲线的稳定性，提高结果可信度。
ROX 校正：单独包装的 ROX 染料，使用更灵活，结果更准确。

人源FEN1基因已知SNP (rs174538)的

HRM鉴定结果

候选基因的筛选思路

① 基因启动子甚至是上游转录调控元件发生序列变异，造成目标基因的表达水平出现显著改变。

② 变异位置位于基因编码区，导致编码蛋白中的重要结构域失活、或是造成蛋白翻译提前终止，转录本可变剪切编码多种蛋白等情况。

假设最终的定位区间里注释含有多个开放阅读框，可先从转录水平查看其中基因的表达水平是否出现显著变化。

提取和鉴定目标基因的注意事项

富含酚类的植物样本在细胞裂解时，容易在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的醌类物资，影响核酸的提取及降低提取质量，可在提取液中加入PVP和β-巯基乙醇可以帮助有效降低酚类物质的影响。
反转录需特别注意避免基因组DNA污染，应尽可能选择含有基因组去除步骤的反转录试剂盒。
需根据物种和组织选择适当的管家基因作为内参进行表达分析。

荧光定量实验过程中经常容易出现样品扩增效率极低、模板浓度太低、Ct值出现太晚等棘手问题，为了更高效地完成荧光定量的检测，推荐使用FastReal快速荧光定量PCR预混试剂（SYBR Green） （目录号：FP217）。

反应快速：预混Mix中的热启动型Taq DNA聚合酶，热启动时间短，酶活性高，反应快速；反应Buffer中的组分，经过针对性改造，可大大缩短变性、退火与延伸时间，可节省多达50%的反应时间，快速获得实验结果。
扩增能力强：新的热启动Taq DNA聚合酶，配合优化的PCR Buffer体系，保证了试剂的高扩增效率和产物的特异性，并且具有扩增曲线起峰早，荧光值高的特点。
仪器广泛适用：不仅适用于快速定量仪器，同样适用于普通定量仪器。

除了对候选基因从转录水平进行鉴别意外，还需要对候选基因的序列变异进行检测，以此判断造成基因功能变异的根本原因。根据变异位置可分为两种情况：