一篇软文教你搞定单细胞拟时序分析新工具—Slingshot

轨迹推断(TI，trajectory inference)是研究细胞动力学的重要方法，它是单细胞研究应用中一种常见的手段。目前已经开发出了大量的轨迹分析算法，最为人熟知的是monocle系列，这些算法都可以很好的计算细胞之间的表达模式并模拟分化过程，但由于数据集之间各有差异，单一的分析方法并不能满足所有数据需求，因此，了解多种TI方法更有助于我们得到最适配自己数据集的TI结果。今天，我们就来介绍一种新的分析方法——Slingshot。

我们采用R语言Slingshot包进行分析，运行Slingshot包需要输入包含用于谱系推断的坐标矩阵的数据对象。支持的类型包括：matrix、SingleCellExperiment、SlingshotDataSet、PseudotimeOrdering。对象中同时需要包含降维数据矩阵（类似基因表达矩阵）和聚类标签向量(聚类赋值矩阵，类似seurat对象中的meta.data数据），由于Slingshot工具的灵活性，我们可以使用矩阵数据进行降维聚类后分析，也可以直接使用降维聚类完成的Seurat对象进行分析。

这里我们以Seurat对象为例，首先，将降维后的seurat对象转换为SingleCellExperiment对象。 （本文所有示例数据为测试数据）

sce <- as.SingleCellExperiment(seurat_ob)

接着，我们就可以用slingshot函数进行轨迹推断，可以指定轨迹的起点和终点，这里指定cluster1为起点。

sce <- slingshot(sce, clusterLabels = “clusters”, reducedDim = “UMAP”, start.clus= 1)

Slingshot函数封装了getLineages和getCurves函数，更为便捷，它使用基于聚类的最小生成树在聚类上执行轨迹推断，并同时计算平滑的、分支路径的主曲线。

让我们来可视化看看结果：

图1 Slingshot模拟分化轨迹图

图片说明：根据Slingshot轨迹推断结果绘制的平滑曲线，并映射到降维聚类图上，图中的点代表细胞，颜色代表不同的细胞类型/细胞群，黑色实线为细胞分化轨迹，每条线代表一个分化谱系。

图2 Slingshot伪时间图

图片说明：根据每条谱系绘制伪时间值推断结果，图中的点代表细胞，黑色实线为细胞分化轨迹，颜色由红到蓝表示伪时间从早到晚，灰色部分细胞代表不属于该谱系。

TradeSeq具有广泛的适用性，可以用于大多轨迹分析的下游。tradeSeq^[2]可以沿着轨迹分析基因表达模式。目前已经开发并应用于单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据，但其适用性不仅限于此，还允许分析单细胞ATAC-seq数据沿轨迹或批量RNA-seq时间序列数据集。它可以为数据集中的每个基因拟合一个广义加性模型(GAM)，并通过评估GAM模型参数的对比来对GAM进行统计推断，以便解释复杂的数据集。

如下图所示，tradeSeq包基于Wald测试统计方法开发了多种检验方法来比较谱系内和谱系间的基因差异，可以用于不同的基因筛选模式,最终在筛选基因后进行可视化处理。 

图3 目前在tradeSeq包中实现的检验方法^[2]

图片说明：DE：存在差异，NOT DE：没有差异；Within the orange lineage：在橙色曲线代表的谱系中比较基因表达差异；between the orange and blue lineages：比较橙色和蓝色两个谱系之间的基因表达差异。

我们使用tradeSeq包来实现Slingshot的下游分析， 首先需要用fitGAM函数为数据集中的基因进行模型拟合。

gamlist_sce <- fitGAM(counts=as.matrix(assays(sce)$counts), sds=SlingshotDataSet(sce))‍

随后，可以根据所需的检验方法筛选出差异基因，绘制热图和曲线图。

图4 拟时序基因表达热图

图片说明：文件每一行代表一个基因，横轴由左到右表示时间从早到晚，颜色由蓝色到红色表示基因的表达量由低到高，对时间发育轨迹中具有相似表达模式的基因进行聚类。

图5 拟时序基因表达曲线图

图片说明：横轴由左到右表示时间从早到晚，纵轴为基因的表达量，不同颜色的点代表不同细胞群，可以看到随着时间变化在不同细胞群中基因表达趋势的变化，不同颜色的线代表不同谱系基因表达曲线。

Wouter Saelens等人^[3]使用几个指标（包括推断排序的准确性、网络拓扑的正确性、代码质量和用户友好性）对29种轨迹推断方法进行评估，发现Slingshot, TSCAN和Monocle DDRTree，明显优于其他方法，但它们的性能取决于数据中呈现的轨迹类型。Slingshot对于预测线性、分叉和收敛等轨迹的表现出色，适用于不太复杂的轨迹推断。

Slingshot分析方法灵活准确，在今年2月份我司客户文章《单细胞RNA测序揭示玉米根尖的形态，以及细胞类型特异性硝酸盐反应基因的鉴定》^[4]中，作者采用Slingshot算法进行分析，发现了起点相同的两个分支，并对这些细胞可以进一步分为四个亚群 。推断出轨迹起源于表皮细胞 (亚群1和2)，并逐渐以根毛细胞 (branch 1) 和成熟的表皮细胞 (branch 2) 两种分化的细胞类型结束。

今天我们对Slingshot的简介就到此，不知道Slingshot的广泛适用性是否可以为您所需的谱系分化TI分析提供了一个选择呢？感谢您的阅览与学习。

参考文献：

[1] Street, K., Risso, D., Fletcher, R. et al. Slingshot: cell lineage and pseudotime inference for single-cell transcriptomics. BMC Genomics 19, 477 (2018). https://doi.org/10.1186/s12864-018-4772-0 

[2]Van den Berge, K., Roux de Bézieux, H., Street, K. et al. Trajectory-based differential expression analysis for single-cell sequencing data. Nat Commun 11, 1201 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-14766-3 

[3]Saelens, W., Cannoodt, R., Todorov, H. et al. A comparison of single-cell trajectory inference methods. Nat Biotechnol 37, 547–554 (2019). https://doi.org/10.1038/s41587-019-0071-9
[4]X. Li, X. Zhang, S. Gao, F. Cui, W. Chen, L. Fan, Y. Qi, Single-cell RNA sequencing reveals the landscape of maize root tips and assists in identification of cell type-specific nitrate-response genes, The Crop Journal (2022), doi: https://doi.org/10.1016/j.cj.2022.02.004

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排版人：小久

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