稳定性同位素标记
在无细胞表达中的应用
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E. coli大肠杆菌“标签”S30裂解物用于优化的cellfree NMR样品制备!
Received: 13 March 2023 / Accepted: 10 May 2023
1摘要
利用高效大肠杆菌裂解物进行无细胞(CF)合成是制备用于核磁共振研究的标记蛋白的一种便捷方法。尽管CF裂解物的代谢活性降低，但提供的同位素标签仍然存在一定的混乱。大多数问题是氨基酸L-Asp、L-Asn、L-Gln、L-Glu和L-Ala的15N标签转换，导致核磁共振信号不明确以及标签稀释。特定的抑制剂抑制了大多数不希望的转化反应，同时需要考虑有限的可用性和对CF系统生产力的潜在副作用。作为解决CF系统中核磁共振标签转换的替代途径，本文描述了具有降低氨基酸混乱活性的优化大肠杆菌裂解物的生成。策略是基于大肠杆菌菌株A19的标准化CF S30裂解物的蛋白质组蓝图。鉴定出的具有氨基酸乱序活性的裂解酶通过相应的单染色体和累积染色体突变在A19中被消除。分析了从突变体中制备的CF裂解物的CF蛋白合成效率和剩余的置乱活性。含有累积突变asnA、ansA/B、glnA、aspC和ilvE的A19衍生物“Stablelabel”产生了最有用的CF S30裂解物。我们证明了在“Stablelabel”裂解物中合成的选择性标记蛋白CF的优化NMR光谱复杂性。通过利用“Stablelabel”中ilvE缺失的优势，我们进一步举例说明了用质子泵蛋白视紫红质对膜蛋白进行甲基特异性标记的新策略。
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关键词
无细胞表达·稳定同位素置换·蛋白质标记·S30裂解物·膜蛋白核磁共振·代谢工程。
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材料与方法
本研究中使用的所有15N标记的氨基酸以及标记的α-酮异戊酸(3-甲基- 13c, 3,4,4,4 - d4) (KIV)购自美国剑桥同位素实验室公司(CIL)。根据文献报道合成了标记的4-甲基-2-氧戊酸(4-甲基- 13c, 3,3,4,5,5,5 - d6) (MOV) (Lichtenecker et al. 2015)。
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蛋白质的同位素标记与纯化
Proteorhodopsin (PR)使用先前发表的修改方案进行表达和纯化(Reckel et al. 2011)。PR在含有0.4% (w/v)糖薯蓣皂苷元(GDN)和0.1% (w/v) diC7PC的pIVEX2.3d-proteorhodopsin-6×His质粒中CF表达，通过c端6×His-tag纯化。PR甲基标记的样品在19个未标记氨基酸的存在下CF合成，由KIV(3-甲基- 13c, 3,4,4,4 - d4)转化为1 mM L-Val(4- 13c, 2,3,3,4,4 -D5)或由MOV(4-甲基- 13c, 3,3,4,5,5,5 - d6)转化为0.5 mM L-Leu (5- 13c, 2,3,3,4,4 - d7)。收获后，将样品应用于用核磁共振缓冲液(25 mM Na-acetate, pH 5.0，含0.1% (w/v) diC7PC)平衡的IMAC柱。结合蛋白用20 mM咪唑的15 CV核磁共振缓冲液洗涤，去除杂质和GDN。样品用含有300 mM咪唑的核磁共振缓冲液洗脱。然后用10个MWCO离心超滤装置将洗脱液浓缩至1ml的体积。将缓冲液在PD Miditrap G25柱上交换为不含咪唑的NMR缓冲液，再用10 MWCO离心超滤装置浓缩。最终样品还含有100µg/mL链霉素、1 ×完全蛋白酶抑制剂、0.15 mM三甲基硅丙磺酸钠和5% D2O。
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NMR测试
CypD的所有[15N, 1H]-TROSY光谱均在样品温度为303 K的Bruker 600 MHz (Avance II)、700 MHz (Avance III HD)、800 MHz (Avance III HD)、900 MHz (Avance Neo)和950 MHz (Avance III)核磁共振光谱仪上获得，并配备低温1H{13C/15N}三共振探针。为了利用扫描之间的纵向1H弛豫增强，将带选择性激发短瞬态(BEST)方法应用于带宽为4.8 ppm的质子脉冲，以8.7 ppm为中心(Farjon et al. 2009)。日志含义设置interscan时延为0.3 s。所有CypD样品在5 mm核磁共振管中浓度为100-150µM，样品体积为600µL。PR的甲基1H-13C相关光谱在样品温度为313 K时，在配备低温探针的Bruker Avance Neo 950 MHz光谱仪上获得。采用XLALSOFAST-HMQC脉冲序列，将13C-1H回传周期缩短为2 ms，并结合延迟解耦(Rößler et al. 2020a)。扫描之间的延迟设置为0.7秒。利用梯度相干选择，该序列可以有效地消除洗涤剂和醋酸盐信号中较强的11 -噪声。L- val (4- 13c, 2, 3,4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4，-D5)标记的样品和L- leu (5- 13c, 2, 3, 3,4, 5, 5, 5, 5- d7)标记的样品在5 mm NMR管中，样品体积为600µL，浓度分别为80µM和120µM。
图4：用A19或“Stablelabel”S30裂解物选择性CF标记CypD(43-207)。光谱覆盖图显示了使用A19(红色)或“Stablelabel”(蓝色)S30裂解物用15NL-Asp (a)、15N L-Glu (b)、15N L-Asn(c)或15N L-Gln (d)选择性标记CypD的结果。b中的黄色光谱是在CF反应中加入20 mM AOA抑制L-Glu到L-Ala标签转化后得到的。在CypD表达前，CF裂解物与5 mM DON在RT下孵育1小时，得到d中的黄色光谱。[15N, 1H]在100-150µM浓度的CypD样品上，在pH 7.0的磷酸钠缓冲液中，在303 K下测量BEST-TROSY光谱。所有A19光谱记录在900或950 MHz光谱仪上，而“稳定标签”光谱记录在600或700 MHz光谱仪上。
图5：用A19(红色)、gltB M5(黄色)或glmSM1 -3-4-6-7(蓝色)的裂解物表达的CypD CF的15N L-Gln标记。突变体裂解物中L-Gln的混乱证实了几种酶有助于谷氨酰胺酶的活性，单一突变体不能充分减少L-Gln到L-Glu的转化。[15N, 1H]用100-150µM的CypD样品在Na-phosphate中，pH 7.0，在303 K下获得BEST-TROSY光谱。A19和M5光谱分别在900 MHz和700 MHz谱机上记录，M 1 -3-4-6-7光谱在700 MHz谱机上记录。
图6：选择性CF标记CypD(43-207)用“Stablelabel”S30裂解物低轮廓水平。蓝色光谱显示了使用“Stablelabel”标记15N L-Asp (a)、15N L-Glu (b)、15N L-Asn (c)或15N L-Gln (d)的CypD选择性标记结果。b中的黄色光谱是在带有“Stablelabel”的CF表达中加入20 mM AOA抑制L-Glu到L-Ala标签转换后得到的。d中的黄色光谱是在CypD表达前，“Stablelabel”裂解物与5 mM DON在RT下孵育1小时后得到的。[15N,1H]在100-150µM浓度的CypD样品上，在pH 7.0的磷酸钠缓冲液中，在303 K下测量BEST-TROSY光谱。光谱记录在600或700 MHz光谱仪上。
图9：提供的IlvE将KIV(3-甲基- 13c, 3,4,4,4 - d4)转化为L-Val(3-甲基- 13c, 2,3,4,4,4, 4, 4, 4, 4, 4, 4-甲基- 13c, 3,3,4,5,5,5 - d6)转化为L-Leu(4-甲基- 13c, 2,3,3,4,4,5,5,5 - d7)前体。a未转换KIV(红色)、75mm KIV和75mm L-Glu转换后的KIV(蓝色)和75mm KIV和300mm L-Glu转换后的KIV(黄色)的叠加图。b未转换MOV(红色)和转换后的MOV与24 mM MOV和100 mM L-Glu(蓝色)的叠加。[13C, 1H]-HSQC光谱在T=313 K时，在Bruker Avance II 500 MHz光谱仪上记录，该光谱仪配备了室温1H{13C/15N}三轴梯度三共振探头。前驱体转化在100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl溶解于D2O和1 mg/mL IlvE中进行。转化完成后，通过超滤去除IlvE，将混合物1:50稀释在25 mM Na-acetate, pH 5.0含5% D2O和0.15 mM DSS中。在相同的条件下测量未转化前体。
6结论
核磁共振样品的CF生成需要一个多功能和不断增长的工具箱来优化标记方案并克服非期望副作用的问题。构建的A19“Stablelabel”衍生物和由此产生的S30裂解物为CF表达平台增加了新功能，进一步促进了特定蛋白质的标记选择。对于L-Asp和L-Asn的15N标记，不需要额外的抑制剂。L-Glu的标记是通过添加AOA和L-Gln来抑制L-Ala的弱置乱来实现的，L-Glu的置乱可以通过DON处理裂解物来解决。此外，从特定甲基标记的前体中控制酶促L-Val和L-Leu转化的应用可以帮助解决复杂疏水环境中更大的膜蛋白的核磁共振分析。
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青岛腾龙微波科技有限公司作为
美国剑桥CIL中国总代理
青岛腾龙微波科技有限公司作为美国剑桥CIL中国总代理，提供全系稳定性同位素标记产品。剑桥同位素实验室(CIL)是世界上分离和制造稳定同位素和稳定同位素标记化合物的领导者。CIL一直是核磁共振和MRS/MRI研究应用的稳定同位素的主要供应商。这些产品包括各种RNA/DNA产品，最小培养基试剂(碳水化合物，铵盐)无细胞表达试剂和试剂盒，游离和保护氨基酸，以及真核和原核细胞系的细胞生长培养基。此外，CIL还提供一系列氘化溶剂，洗涤剂和缓冲液。产品经过专门设计和测试，并考虑到最挑剔的核磁共振波谱学家和结构生物学家。与客户合作积极支持核磁共振领域研究。
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