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使用腺相关V病毒(AAV)作为基因治疗中递送ssDNA的有效载体持续热门。
与任何蛋白质一样,病毒蛋白(VPs)也会受到翻译后修饰的影响,从而影响其稳定性、衣壳组装和整体功效。因此,肽图谱可以用来评估这些修饰的存在和鉴定。
AAV具有典型生物制剂所没有的额外复杂性。病毒衣壳是由三个衣壳或病毒蛋白组成的60蛋白二十面体,以1:1:10的比例(VP1:VP2:VP3)非共价组装。传统的肽消化方法足以产生预期的结果。虽然给定序列同源性,但是多肽重叠和不重叠序列信号强度的变化应该可预期。
在本应用中,我们分析了AAV5和AAV9的衣壳蛋白肽,使用Biozen Peptide XB-C18反相色谱柱用胰蛋白酶酶切。结果表明,Biozen Peptide XB-C18色谱柱具有良好的峰容量和分离能力,具有高水平的序列覆盖率。
样品制备
样品:
20µL AAV浓度为2E13vg/mL
变性剂:
50%v/v 三氟乙醇
还原剂:
2mM三羧酸乙基膦
孵育:
70°C下30分钟
烷基化:
2mM碘乙酰胺
孵育:
22°C下30分钟, 在黑暗条件下
稀释:
以100mM碳酸氢铵, pH8.25稀释4.5倍
酶解:
1:25w/w Trypsin
孵育:
37°C下18小时
淬灭:
0.4%v/v with 10%甲酸
浓度:
SpeedVacto浓缩至约25%最终反应体积
复溶:
加入等体积的25mM碳酸氢铵,pH为8.25
LC 条件
色谱柱:
Biozen 2.6µm Peptide XB-C18
规格:
150x2.1mm
订货号:
00F-4768-AN
流动相:
A: 0.1% 甲酸水
B: 0.1% 甲酸乙腈
梯度:
Time (min) %B
0 2
50.5 60
55.5 60
60.0 90
63.0 90
63.1 2
70.0 2
流速:
0.3mL/min
进样体积:
1µL
温度:
60°C
仪器:
UHPLC
检测器:
MS
MS 条件
Scan Type:
Full MS
Resolution:
70,000
AGC Target:
3e6ms
Maximum IT:
200ms
Scan Range:
200 to 2000m/z
Scan Type:
MS2
Resolution:
70,000
AGC Target:
1e5ms
Maximum IT:
200ms
图1 Peptide Mapping of AAV5 VPs, 浓度6.7E12 vg/mL (约55 ng/µL).
Protein Name
#Peptides
%Coverage
# AAs
>tr|Q9YIJ1|Q9YIJ1_9VIRU Capsid protein OS=adeno-associated virus 5 OX=82300 GN=cap PE=1 SV=1
193
93.6
723
图2 Peptide Mapping of AAV9 VPs, 浓度6.7E12 vg/mL (约55 ng/µL).
Protein Name
#Peptides
%Coverage
# AAs
>tr|Q6JC40|Q6JC40_9VIRU Capsid protein VP1 OS=Adeno-associated virus 9 OX=235455 GN=cap PE=1 SV=1
205
92.7
768
结论:
使用酶解法对腺病毒衣壳蛋白进行酶解后,使用Biozen Peptide XB-C18色谱柱进行分析,可以覆盖92%以上的蛋白序列。