微小而强大——采用微流液质联用技术(Microflow LC-MS/MS)提高反义寡核苷酸(ASO)生物分析的灵敏度

背景提要

^【1】反义寡核苷酸(ASOs)是合成而来的短寡核苷酸单链。随着近二十年ASO修饰技术的发展，新一代ASO结合非编码RNA以及与疾病相关RNA，进一步扩大了靶点的选择，使ASOs成为治疗神经退行性疾病，心血管疾病和癌症等多种疾病的高潜力候选者。生物基质中ASOs的定量生物分析对于评估ASOs的药代动力学、药效学和毒理学特性至关重要，通常需要建立超灵敏的分析方法来定量样本中低浓度的ASOs。

本研究评价了微流LC和样品洁净程度对ASOs液质分析灵敏度提高的影响。首先，研究者分别使用微流LC和传统分析LC对目标物质ASO-001进行液质定量分析，对比其灵敏度差异；而后，评估了不同的样品前处理方法，即特异性杂交(Hybridization)，固相萃取(SPE)和蛋白沉淀法对微流LC灵敏度提升的影响。结果显示，微流LC显著增强ASO生物分析的灵敏度，并且样品经前处理提取过程后的溶液越干净，灵敏度提高越显著。本研究建立的超灵敏微流LC-MS/MS方法对于血浆中ASO-001的定量下限达0.100 ng/mL。

微流LC与分析LC的灵敏度比较

为了确保对比实验不受色谱柱其他参数的影响，本文选择Phenomenex具有相同填料和柱长的三支不同内径 (2.1、0.5和0.3mm) 的Gemini系列色谱柱：常规分析柱 (Gemini 3μm C18, 50×2.1mm)和两支微流柱 (Microcolumn Gemini 3μm C18, 50×0.5mm和50×0.3mm)。

采用三支不同内径的色谱柱分析纯溶液 (ASO稀释液) 中ASO-001。图1表明，微流色谱法可以提高分析ASOs的灵敏度，0.5mm (20μL/min) 和0.3mm (10μL/min) 内径微流柱比2.1mm内径分析柱的灵敏度 (S/N) 分别提高了4.8倍和6.3倍。研究者也测试了微流LC对其他ASOs化合物灵敏度提升的影响，相对于常规分析LC，总体上灵敏度均有4到6倍的提高，具体效果与化合物相关。该结果也与其他使用微流或纳流提高小分子和多肽灵敏度的研究一致。

图1. 浓度0.1 ng/ml ASO-001 的ASO稀释液在三支色谱柱上的分析谱图

(A) Gemini 3μm C18, 50×2.1mm，(B) Gemini 3μm C18, 50×0.5mm，(C) Gemini 3μm C18, 50×0.3mm。

样品清洁度对微流LC灵敏度提高的影响

采用两种ASO样品制备方法,固相萃取法 (Phenomenex Clarity OTX SPE plate, OTX lysis-loading buffer) 和特异性杂交法（自制捕获磁珠）处理空白大鼠血浆，处理后的溶液用0.1或1ng/mL的ASO-001做后加标分析，评价样品的清洁程度对微流LC灵敏度提高的影响。

如图2结果显示，对于0.1ng/mL ASO-001，如果使用一步法SPE净化后，再用微流LC分析，灵敏度 (S/N) 提高约3倍，而如果使用特异性杂交法净化基质，灵敏度 (S/N) 提高5.6倍，与纯溶液中的表现相似。对于1ng/mL ASO-001，也观察到类似的S/N改善趋势。这些结果表明，当从常规分析LC切换到微流LC时，样品清洁度对灵敏度提高有重要影响。杂交以其对目标ASO的高度特异性提取，可为各种生物基质提供高效的样品净化，而使用SPE净化虽不如杂交法的洁净度高，但明显比蛋白质沉淀等其他样品前处理法更清洁，且无需做特异性试剂准备和材料制备，具有一定的通用性。

图2. 0.1ng/ml ASO-001后加标至不同基质净化方法所得的溶液在常规/微流色谱柱上的分析谱图对比

(A) 杂交法提取, 50×2.1mm常规柱分析，(B) 杂交法提取, 50×0.3mm微流柱分析，(C) SPE法提取, 50×2.1mm常规柱分析，(D) SPE法提取, 50×0.3mm微流柱分析。

结论

本研究采用微流LC-MS/MS提高了ASOs生物分析的灵敏度，内径0.3mm的微流色谱柱比内径2.1mm传统分析柱，对ASO-001分析的灵敏度提高了6倍。并且洁净程度越高的样品前处理方法越有利于促进微流LC灵敏度提高。本方法可用于大鼠血浆中ASO-001的定量分析。展望未来，在需要超灵敏方法来定量生物基质中低丰度ASOs的情况下，微流LC将是一种有效手段来提高方法灵敏度。

参考文献

【1】Di Jiang & Long Yuan. Microflow LC–MS/MS to improve sensitivity for antisense oligonucleotides bioanalysis: critical role of sample cleanness. Bioanalysis (2022) 14(21), 1365–1376

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