全面揭秘衍生技术在液相色谱分析中的应用

月旭科技

2023.9.11

作者月旭科技

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Hello！小伙伴们大家好，你是否在日常工作中遇到一些化合物难以用常规的实验手段分析的情况，这时候我们应该怎么办呢？衍生是一种不错的选择方式，今天就跟小编一起来了解下衍生技术在液相色谱中的应用，看看她是如何帮我们克服难题的吧。

（图片来源：包图网）

化学衍生法是指借助化学反应将待测组分接上某种特定基团，从而改善其检测灵敏度和分离效果的方法利用化学衍生反应达到改变化台物特性的目的，使其更适用于特定分析的过程，在仪器分析中被广泛应用，如色谱（包括气相、液相、超临界、薄层、电泳和一些联用技术等）、质谱、核磁、紫外一可见、荧光和电化学分析等。

气相色谱与液相色谱衍生的差异

气相色谱中应用化学衍生反应是为了增加样品的挥发度或提高检测灵敏度，而高效液相色谱和毛细管电泳的化学衍生法是指在一定条件下利用某种试剂（通称化学衍生试剂或标记试剂）与样品组份进行化学反应，反应的产物有助于色谱检测或分离。

液相色谱衍生技术的分类

液相色谱衍生化技术是色谱分析中常用的辅助手段。衍生技术可以解决目标物保留性差、不稳定、常规检测方法不能直接检测或检测灵敏度比较低等问题。液相色谱仪的衍生技术是指将待测物与某种试剂即我们通常称的衍生试剂反应，使之生成易于检测的化合物的过程。衍生化反应从是否形成共价键来说，可分为两种：标记和非标记反应。标记反应是在反应过程中，被分析物与标记试剂之间生成共价键。所有其它类型的反应，如形成离子对、光解、氧化还原、电化学反应等都是非标记反应。

另一种区分衍生化反应是从衍生反应的场所来分，有柱前衍生化 (pre-column derivatization)，柱上衍生化 (on-column derivatization)和柱后衍生化 (post-column derivatization)三种。

从是否与仪器联机的角度来分有：在线 (on-line)、离线(of-line)和旁线 (at—line)(自动化)三种。

使用意大利HT4000A自动样品处理工作站，可完成复杂的多重自动化衍生操作，如下图所示，不同品牌液相搭配HT4000A自动样品处理工作站均可实现离线、在线或旁线衍生。

液相衍生技术常见的反应

目前在 HPLC中以离线的柱前衍生法（简称柱前衍生法）与在线的柱后衍生法（简称柱后衍生法）使用居多。旁线衍生法常用的反应有酯化、酰化、烷基化、硅烷化、硼烷化、环化和离子化和光化学反应等。

HT4000A衍生——涡旋混合

液相色谱衍生技术常用的衍生方式

接下来我们一起来看看衍生的不同方式

柱前衍生

第一种方式将被测物转变成可检测的衍生物后，再通过色谱柱分离。即将被测物和衍生试剂分别通过两个或多个输液泵送到反应器里混合，并使之立即反应完成，随之进入色谱柱，这就是在线柱前衍生了；

也可以先将被测物和衍生试剂反应，再将衍生物作为样品进样，进行色谱分析，此时该方法为离线柱前衍生；有的文献中提到也可以在流动相中加入衍生试剂，进样后，让被测物与流动相直接发生衍生反应这样就是在线衍生。

柱后衍生

柱后衍生是指先将被测物分离，再将从色谱柱流出的溶液与衍生试剂在线混合，生成可检测的衍生物，然后导入检测器。按生成衍生物的类型可分为紫外可见光衍生、荧光衍生、拉曼衍生和电化学衍生和光化学衍生等。

氨基酸柱后/柱前衍生示意图

1、紫外可见光衍生：

1）紫外衍生是指将紫外吸收弱或无紫外吸收的有机化合物与带有紫外吸收基团的衍生试剂反应，使之生成可以用紫外检测的化合物。如胺类化合物容易与卤代烃、羰基、酰基类衍生试剂反应。

2）可见光衍生有两个主要的应用：一是用于过渡金属离子的检测，将过渡金属离子与显色剂反应，生成有色的配合物、螯合物或离子缔合物后用可见光检测；二是用于有机离子的检测，在流动相中加入被测离子的反离子，使之形成有色的离子对化合物后，分离检测。

2、荧光衍生：

荧光衍生是指将被测物与荧光衍生试剂反应后生成具有荧光的物质进行检测。有的荧光衍生试剂本身没有荧光，而其衍生物却有很强的荧光。衍生技术不仅使液相色谱仪分析体系复杂化，而且需要消耗时间，增加分析成本，有的衍生反应还需要控制严格的反应条件。因此，只有在找不到方便而灵敏的检测方法或为了提高分离检测的选择性时，才考虑用衍生技术。

3、光化学衍生：

光化学衍生（PhotoChemical Derivatization, PCD）分析法是基于光化学反应而建立的一类分析方法，它以其独特的衍生方式与传统的荧光，化学发光，紫外-可见，电化学等检测方法相结合，提高了原有方法的灵敏度与选择性，极大地拓展了传统检测方法的应用范围，在药物、复杂生物样品，环境样品分析测定等方面得到广泛应用。

柱后化学衍生反应主要以荧光分析为主，也有以电化学检测的分析方法。光化学反应的主要类别如下：分子内能量转移、碰撞能量转移、淬灭、光致离子化、异构化、直接反应、分子间分解。