什么是活细胞荧光成像？
活细胞荧光成像用于观察动态细胞过程并随时间跟踪细胞生物分子和结构。活细胞荧光成像能够分析天然状态的细胞，从而保留细胞功能，能够研究细胞骨架重排、细胞凋亡、细胞迁移、内吞作用、吞噬作用和细胞器动力学等细胞过程，是药物发现、癌症、发育生物学、环境科学和其他医学领域研究的利器。
如何选择活细胞成像试剂
活细胞成像试剂包括靶向性荧光融合蛋白和膜渗透荧光染料。许多活细胞成像试剂可用于数小时或数天的延时成像，也有一些试剂适合终点检测、细胞染色后立即成像和分析。染色浓度、孵育时间、成像时间和间隔/频率应根据经验确定，以尽量减少细胞毒性并保留细胞功能。
下面的活细胞成像指南中的试剂与自动化高内涵和基于培养箱的荧光成像系统兼容，例如：配备 EVOS Onstage 培养箱的 Thermo Fisher Scientific 的 EVOS M7000 和 M5000 细胞成像系统、CellInsight HCS 高内涵平台、PerkinElmer 的 MuviCyte™ 活细胞成像系统、Leica 的 Thunder 和 Mica 以及 Sartorius 的 Incucyte® 活细胞分析系统™。
活细胞成像试剂选择指南
如何在活细胞成像过程中控制成像环境
荧光成像平台与培养箱相结合，可提供受控且稳定的环境，允许对自然状态下的细胞进行长期成像。用于 EVOS M7000 和 M5000 细胞成像系统的 EVOS Onstage 培养箱以及用于在 CellInsight HCS/HCA 平台上进行自动化高内涵筛选和分析的 Invitrogen HCA Onstage 培养箱，可对活细胞进行延时和动态成像及分析 。在环控条件下进行活细胞长时间成像时，试剂应加在细胞培养基或用碳酸氢盐为缓冲体系的 FluoroBrite DMEM（货号 A1896701）中，以在 5% CO₂ 环境中维持生理 pH 值。
活细胞成像在细胞功能分析中的应用示例
示例1：活细胞成像检测细胞凋亡
细胞凋亡是一种严格控制的程序性细胞死亡过程，用于去除多余的、受损的和不需要的细胞或组织。细胞凋亡可以通过 caspase 激活、DNA 片段化、线粒体活性破坏和质膜变化来检测。CellEvent Caspase 3/7 试剂是荧光型 caspase 底物，可检测 caspase 激活以测定活细胞的细胞凋亡。这些试剂不需要洗涤步骤，可用于 48 小时或更长时间的实时和延时活细胞凋亡成像。
图 1. CellEvent Caspase-3/7 Green 试剂（货号 C10432）检测细胞凋亡的工作流程。
将待测细胞铺到孔板内，然后加入稀释的 CellEvent Caspase-3/7 Green 检测试剂。CellEvent Caspase 3/7 染料可直接在完全培养基中使用，无需清洗。最快可在试剂加入30分钟后开始检测荧光，最长可达 72 小时。
图 2. 使用 CellEvent Caspase 3/7 Green 染色检测细胞凋亡的示例。
HuVEC 细胞用 CellEvent Caspase 3/7 Green Assay（货号 C10432）染色处理，并在处理后 0、24、48 和 72 小时使用 Incucyte® ZOOM 活细胞分析系统成像。（数据来源请见文末“参考文献”）
示例2：活细胞成像实验中的线粒体活性
活细胞成像试剂包括用于识别细胞成分的细胞结构试剂和用于分析细胞功能和过程的细胞功能试剂。例如，MitoTracker 染料在活细胞的活性线粒体中积累，并共价附着在线粒体上，以评估线粒体定位和丰度。相比之下，TMRM 和 TMRE 是动态线粒体膜电位指示染料，它们会根据膜电位在线粒体内外流动。
图 3. 监测活细胞中的活性线粒体。
培养患者的成纤维细胞系，并用 MitoTracker Red（货号 M22426）、Image-iT DEAD Green 染料（货号 I10291）、Hoechst（货号 R37165）染色，并在 Incucyte® ZOOM 活细胞成像系统上检测和分析。（数据来源请见文末“参考文献”）
活细胞成像流程和注意事项
图4. 经典的活细胞成像流程。
包括：实验计划、细胞培养、细胞标记、信号优化和上机成像。
众所周知，活细胞需保持在天然的生理条件范围内，包括 pH、温度、O₂ 水平和渗透压等等，维持细胞的健康和功能活性十分重要。
所以，实验设计和操作过程中需特别注意：
须通过特定方法实现以最小毒性标记靶标——无论是靶分子、细胞功能还是细胞状态；
活细胞通常很难允许某些大的检测分子通过；
移动的观察目标更难保持聚焦；
使用的检测技术是否对活细胞有损伤。
当然，随着实验需求不断变化，需要注意的点也会有所不同。
举例来说，研究细胞生长与细胞分裂的实验可能与研究受体激活等实验就具有明显不同的需求。
一些强健的永生化细胞系能在无专门环境控制的条件下忍受短时成像；
在某些短时成像实验中，使用较大的培养基体积可避免由于挥发所导致的渗透压和含氧量变化问题；
而对于长时成像研究，除了在培养基中添加碳酸氢盐缓冲系统外，使用带有加热模块可控制温度、湿度与 CO₂ 的小培养室或大温控箱来精确控制环境也十分重要。
随着活细胞成像的普及，对实验中荧光基团标记的要求也越来越高，活细胞成像实验如何实现更好的荧光标记？一起奉上如下注意事项：
如需长时间曝光，请尽量选择用更长波长的荧光试剂，长波长试剂只需较低的激发功率，具有更低的光毒性，可以提供更健康的细胞状态；
推荐针对特定的检测读值、光谱兼容性和信噪比对染色进行优化；
去除标记溶液，并使用新鲜配制的培养基冲洗，可减少背景荧光；
搭配多种荧光基团实现多重标记，推荐使用荧光光谱查看器，以确保荧光染料间光谱重叠最小。
参考文献
· Sambi M, Samuel V, Qorri B, Haq S, Burov SV, Markvicheva E, Harless W, Szewczuk MR. A Triple Combination of Metformin, Acetylsalicylic Acid, and Oseltamivir Phosphate Impacts Tumour Spheroid Viability and Upends Chemoresistance in Triple-Negative Breast Cancer. Drug Des Devel Ther. 2020;14:1995-2019 PMID: 32546966. (图2)
· Smith GA, Jansson J, Rocha EM, Osborn T, Hllett PJ, Isacson O. Fibroblast Biomarkers of Sporadic Parkinson''s Disease and LRRK2 Kinase Inhibition. Mol Neurobiol. 2016 Oct;53(8):5161-77. PMCID: PMC5012155. (图3)
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