新陈代谢已成为免疫细胞命运和功能的关键驱动因素。已经证明，T细胞的代谢重编程可用作提高过继性T细胞疗法抗肿瘤疗效的策略。
安捷伦Seahorse XF分析仪可让您同时测量活细胞中的糖酵解和线粒体活性。XF数据的归一化是数据分析过程中的关键组成部分，以确保准确和一致地解释结果。可以使用多种方法对 XF 测定进行标准化，包括细胞数、基因组 DNA和总细胞蛋白。然而，通过活细胞数归一化是大多数XF应用中使用最广泛的方法。
安捷伦目前支持基于Cytation的荧光成像和细胞计数（或 Cytation-ICC）用于XF检测中的贴壁细胞。
图1 .XF成像和归一化系统的典型工作流程
NovoCyte流式细胞仪就是在这个背景中闪亮登场了。
Seahorse归一化的重要性
T细胞在含有标准（1.15 mM，对照组）或高浓度（7.15 mM，精氨酸组）精氨酸的RPMI-1640培养基中激活并扩增至第9天。扩增后，收集细胞，弃去培养基，并将细胞重悬于含有10 mM葡萄糖，2 mM谷氨酰胺和1 mM丙酮酸的XF RPMI中，浓度约为1.5×105个细胞/ mL。然后，将每个样品的50 μL接种在XF Pro PDL包被的板中，并根据相关指南进行T细胞代谢适应性测定。数据显示：与精氨酸组相比，对照组（黑线）显示出明显更高的基础和最大OCR，并且总ATP产生也更高（图2）。
图2 Seahorse Analytics报告的屏幕截图显示了在常规 RPMI-1640 培养基或补充有额外精氨酸的RPMI-1640培养基中活化和扩增 9 天的T细胞代谢适应性测定中的非标准化 OCR 动力学图和ATP产生速率。
同时，使用 NovoCyte 流式细胞仪分析了XF测定培养基中的总细胞数和活细胞数。XF测定完成，并在XF Pro归一化选项卡中添加了两个样品（对照和精氨酸）的活细胞数。考虑每孔的活细胞数量对数据进行归一化后（图2，注意轴单位的变化），结果是相反的。与对照组相比，Arg组表现出更高的基础和最大OCR，以及更高的总ATP产生率。
图 3 Seahorse 分析器报告的屏幕截图显示了图1的规一化数据。请注意规一化数据的单位。
专家推荐：安捷伦Seahorse XF数据的归一化是每种XF检测都应采用的做法，尤其是在比较不同细胞群以进行正确数据解释时。
NovoCyte绝对计数的能力
NovoCyte流式细胞仪可提供精确的细胞计数，具有高重现性。为了确认NovoCyte流式细胞仪的细胞计数功能在推荐的Seahorse XF平板中接种T细胞的细胞密度范围内的性能，制备了T细胞悬液的梯度稀释液（从> 4 × 106个细胞/mL开始）。对每个测试的样品进行重复三次的细胞计数。此外，用死活染料7-AAD染色，以计数样品中的总细胞和活细胞。在XF测定过程中，需要两种计数来确定最佳接种密度和数据归一化。
如图4和表1所示，在高采样速度下计数时，使用NovoCyte流式细胞仪在分析范围内进行细胞计数具有高精度，CV<5%。在中速下也获得了类似的性能。与预期细胞数目相比，计数的准确性很高。
图4 使用安捷伦NovoCyte Quanteon流式细胞仪在两种不同的采集速度下，实际计数与预期数目的比较。表1显示了在不同采集速度下对同一细胞悬液进行三次测量所获得的%CV值。
Seahorse与NovoCyte进行XF测定的工作流
图5.根据XF T细胞代谢分析试剂盒用户指南使用T细胞进行XF测定的步骤示意图。
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App Note《 使用NovoCyte对seahorse细胞数目归一化》
安捷伦 NovoCyte 流式细胞仪提供了一种简单的解决方案，无需对流体系统进行复杂的校准或使用参比微球，并且样品之间的残留最少。NovoCyte使用小样品体积，提供总细胞和活细胞的准确细胞计数。该方法允许在接种前调整细胞密度，以防初始悬浮密度超出推荐范围。该工作流程还对最终悬浮液计数，该活细胞计数用于归一化接种板。此外，结合 NovoSampler Q，该系统以最少的手动操作时间提供了更高的通量，允许快速计数和制备多个样品，同时节省时间。
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