（图片来源：baotu）
缓冲液的作用是在一定的范围内缓冲调整溶液的pH值，使待测溶液的酸度符合分析方法所规定的范围。其中，磷酸盐缓冲液截止波长低于200nm，在较低分析波长下仍可使用，具有三个pKa值，可提供1.1~3.1，6.2~8.2，11.3~13.3三个pH缓冲范围，是HPLC在紫外检测条件下最常用的缓冲液之一。
配制磷酸盐缓冲液时，通常所说的浓度0.01M指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，而非Na+或K+的浓度，Na+或K+的作用是调节渗透压。
母液的配制：
● 0.2M Na2HPO4：精密称取 28.392g Na2HPO4，溶于1L水中，超声使溶解完全；
● 0.2M NaH2PO4：精密称取23.996g NaH2PO4，溶于1L水，超声使溶解完全。
各种浓度PB(pH=7.4)的配制：
先配0.2M PB（pH=7.4，100mL）：取0.2 mol/L的Na2HPO4母液81mL及0.2mol/L的NaH2PO4母液19mL，混匀。然后只需将0.2M PB（pH=7.4）按相应比例适当稀释即可，如：
● 0.1M PB（pH=7.4）：取500mL 0.2M PB，加水稀释至1L。
● 0.01M PB（pH=7.4）：取50mL 0.2M PB，加水稀释至1L。
● 0.02M PB（pH=7.4）：取100mL 0.2M PB，加水稀释至1L。
其它各种pH值的0.2M PB（100ml）配比：
pH | 0.2M Na2HPO4（mL） | 0.2M NaH2PO4（mL） |
5.7 | 6.5 | 93.5 |
5.8 | 8 | 92 |
5.9 | 10 | 90 |
6.0 | 12.3 | 87.7 |
6.1 | 15 | 85 |
6.2 | 18.5 | 81.5 |
6.3 | 22.5 | 77.5 |
6.4 | 26.5 | 73.5 |
6.5 | 31.5 | 68.5 |
6.6 | 37.5 | 62.5 |
6.7 | 43.5 | 56.5 |
6.8 | 49 | 51 |
6.9 | 55 | 45 |
7.0 | 62 | 38 |
7.1 | 67 | 33 |
7.2 | 72 | 28 |
7.3 | 77 | 23 |
7.4 | 81 | 19 |
7.5 | 84 | 16 |
7.6 | 87 | 13 |
7.7 | 89.5 | 10.5 |
7.8 | 91.5 | 8.5 |
7.9 | 93 | 7 |
8.0 | 94.7 | 5.3 |
以上配制方法可供参考。日常配制流动相时常使用缓冲盐搭配酸/碱溶液进行pH调节。
在使用酸/碱溶液调节缓冲溶液的pH时，使用低浓度（0.1mol/L）比使用高浓度（1mol/L）引起的误差更小，对缓冲溶液pH的重复性和分析结果的重现性更有优势，尤其是针对一些对pH敏感的分析项目。
（图片来源：baotu）
应用案例：
客户反馈参考应用报告的液相条件，同一台液相，不同天配制的流动相，配制方式一样，分离重现性不好，有时能分开，有时会重合无法分离。了解到客户称取磷酸盐后溶于1L超纯水中后，再滴加1mol/L碱溶液进行pH调节。此方法容易造成配制差异，引起峰分离情况差异。
优化流动相配制方法：
① 精密称取Mg±0.001g磷酸盐，溶于约800mL超纯水中溶解。
② 预先配制0.1mol/L氢氧化钠/氢氧化钾溶液，称样量Ng±0.001g，用量筒准确量取100mL碱溶液备用。
③ 将量取的碱溶液缓慢加入已溶解的磷酸盐溶液中，观察pH变化，达到目标pH后，停止加入碱溶液，记录所需碱溶液体积。
④ 再在缓冲盐溶液中加入超纯水定容至1L。
⑤ 后续配制只需量取固定体积的碱溶液加入固定称样量的缓冲溶液中，即可达到固定的pH。成功减小流动相配制差异，提高峰分离重现性。
效果见下图：
1）系统溶液谱图 操作员a配制的流动相
2）系统溶液谱图 （次日）操作员b配制的流动相
方法转移客户，测试后反馈分离重现性良好。
结论：
流动相pH的稳定性与准确性对样品分析的影响较大时，需尽量规避流动相配制时的人员误差，环境误差，仪器误差，物料称量误差等，以保证方法分析效果的重现性。
作者：况熙
排版：赵林
审核：任兴发
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