体外杀伤知多少
体外杀伤实验是肿瘤细胞疗法的重要筛选和评估手段，大家常用的方法有流式、LDH或者基于Luc等终点法。但这些方法对于效应细胞重复杀伤检测来说，你是不是觉得过于繁复。不仅要准备过多的样品/复孔，还需要手动去检测每轮的杀伤，而且很难保证持续监测同一样品孔的多轮次重复杀伤。
注意啦！注意啦！RTCA要放大招啦！
安捷伦xCELLigence RTCA实时细胞分析仪只需简单的步骤就可以实现同一样本孔效应细胞对靶细胞的多轮次杀伤检测（图1）。而且作为无标记的检测，杀伤结束后的细胞还可以用于其他实验的检测，比如流式等。
图1. xCELLigence RTCA检测效应细胞重复杀伤的workflow
01
案例1：实体瘤靶细胞重复杀伤以及T细胞免疫分型检测
RTCA检测 5 轮次重复杀伤AcPC-1靶细胞
分别将ho2R和ho9R武装的anti-MSLN M5 CAR T细胞按照E/T ratio=1:1加入到胰腺癌细胞系AsPC-1中进行5轮次的持续重复杀伤检测，每轮杀伤48h，然后将上一轮杀伤后的CAR T细胞重新计数再按照E/T ratio=1:1 加入到新接种的胰腺癌细胞系AsPC-1中。
结果显示前三次杀伤中ho2R和ho9R两种武装分子并没有区别，而在第四次开始ho9R武装的CAR T细胞杀伤更强，更快的清除孔中的肿瘤细胞。表明ho9R武装增强CAR T细胞的持久性。
流式检测重复杀伤后 CAR T细胞的免疫分型
由于RTCA是无标记的检测，收集最后一轮杀伤结束后的CAR T细胞，应用流式细胞仪检测CD45RA、CD27、CCR7以及CD95等Marker来鉴定T细胞记忆干细胞Tscm的比例。
如猜想的一致，ho9R武装的anti-MSLN M5 CAR T细胞持久性更高的原因是其增加了CAR T细胞中Tscm细胞的比例，因此增强了CAR T的干细胞特性。
参考文献：Potentiating adoptive cell therapy using synthetic IL-9 receptors. Nature 607, 360–365 (2022).
02
案例2：血液瘤靶细胞重复杀伤以及T细胞耗竭Marker的检测
RTCA检测 4 轮次重复杀伤Nalm6悬浮靶细胞
利用Agilent IMT kit预孵育E-plate检测板，使人B淋巴白血病细胞Nalm6细胞贴壁生长，分别将不同E/T比的不同组CAR T细胞加入到Nalm6靶细胞中进行4轮次的持续重复杀伤检测，每轮杀伤检测24h，然后将上一轮杀伤后的CAR T细胞重新计数再按照相同E/T ratio加入到新接种的Nalm6中。
结果表明Sana公司构建的低免通用型CAR T细胞HIP CAR T的体外持久杀伤能力与传统通用型Allo CAR T细胞无差异。
流式检测重复杀伤后 CAR T细胞耗竭Marker的表达
RTCA检测CAR T细胞使无标记无损伤的检测方法，研究者在最后一轮杀伤结束后检测CAR T细胞的耗竭Marker: TIM3、TIGIT、LAG3、CD39、CTLA-4以及PD-1的表达。
结果也表明Sana公司构建的低免通用型CAR T细胞HIP CAR T的耗竭水平与传统通用型Allo CAR T细胞无差异。因此这种低免疫设计在增加通用型细胞治疗产品的安全性的同时也没有影响产品的体外效力和持久性。
参考文献：Hypoimmune anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells provide lasting tumor control in fully immunocompetent allogeneic humanized mice. Nature Communications 14, 2020 (2023) .
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