文章来源：药物递送公众号
脂质纳米颗粒（LNP）是有前途的治疗性核酸递送载体，市场上已有多种FDA批准的基准配方。在合成一致性和放大生产能力方面，冲击射流混合法（辉瑞、moderna在用knauer IJM设备）已成为LNP-mRNA制剂合成方法的领跑者。该方法涉及水相（含核酸载物）和有机相（含脂质混合物）的快速组合，从而形成低多分散性和高包封效率的LNP-mRNA复合物。
在过去核酸药物发展的10-15年中，该领域的大部分研究都集中在siRNA递送上，而mRNA、ASO和适配体递送直到最近几年才受到关注。用于较小核酸载物（例如 siRNA）的脂质递送载体不一定适用于较大RNA载物（mRNA）的递送。根据核酸药物的类型，其大小可跨度10-1929个碱基。此外，核酸载物尺寸对纳米颗粒直径的影响也并不完全清楚。
图1. 不同核酸药物载物的尺寸跨度
为了改进和优化LNP制剂以进行大规模生产，并达到预期的治疗效果，有必要建立LNP制剂的规范化检测体系。其中，主要由几个因素决定了LNP制剂的成功，但第一步往往离不开表征不同大小核酸的包封效率和粒径分布。优化核酸的包封效率将最大限度地减少昂贵材料（即RNA）的浪费，并产生更有效的药物配方。
2024年1月29日，来自核酸药物检测技术公司Nubad, LLC的研究团队在scientific reports上在线发表了题为“A careful look at lipid nanoparticle characterization: analysis of benchmark formulations for encapsulation of RNA cargo size gradient”的研究论文。该团队评估了四种标准LNP制剂对五种不同RNA载物尺寸的包装效率，指出了传统包装效率计算具有的误导性结论。同时，分析表征了RNA尺寸对包封效率，纳米颗粒尺寸和多分散系数的影响。
传统包封效率计算方法的“误导性”
目前用于测定LNPs包封效率的方法主要依靠定量RNA的染料，通过与核酸结合时产生荧光进行RNA浓度的表征。该方法首先将染料加入到未破坏LNPs的样品中，测量未包封的RNA浓度。然后加入洗涤剂溶液破坏纳米颗粒释放包封的RNA，并通过荧光计算样品中RNA的总量。从总RNA中减去未包封的RNA来计算有效包封的RNA以及对应的包封效率。
按照传统方法所得的包封效率（EE%）描述了样品中LNP包封的RNA比例。然而，这种表征计算方法没有考虑用于制备的RNA总量，这一部分包括样品中包封、未包封以及合成中被降解或破坏损耗的RNA。因此，在合成后样品中测得的总RNA浓度不能够完全反映生产中使用的RNA总量。
RNA，尤其是缺乏二级结构的短链（如ASO）极易被RNase降解。LNP配制后的处理步骤（即缓冲液置换、离心浓缩步骤等）可能会由于无意的RNase污染而导致样品中未包封（未受保护）RNA的优先降解。此外，合成过程使用微流控混合，其中快速流速产生的剪切应力可能导致RNA受到机械性破坏，这也将减少样品中RNA的整体含量。若生产不考虑上述降解机制将“错误”地人为提高包封效率。
基于上述考量，研究团队设计了仅改变可电离脂质和辅助磷脂的4种不同LNP制剂（可电离脂质使用ALC-0315和DLin-MC3-DMA，辅助磷脂使用DSPC和DOPE），包封5种常见RNA药物（ASO 10 bases、siRNA 21 base pairs、aptamer 96 bases、mRNA 996 bases和1929 bases），并用两种不同的包封效率计算方法验证（以样品总RNA量为基准传统EE%和以总RNA输入量为基准的EEinput%）。
图2. 实验设计
研究发现，EE%介于88%和100%之间，而EEinput%仅在8%到49%之间。使用MC3和DSPC脂质配方包封96个碱基大小的RNA最能说明差异，其中EE%为100%，但EEinput%仅为8%。在所有三组制备样品中，检测到的未封装RNA几乎为零，意味着样品中的所有RNA都被LNP封装。根据传统计算，得到的包封效率接近100%。该值具有误导性，因为实际上在考虑起始RNA浓度时仅表现出最低的包封效率。研究中平均EEinput%读数比EE%低65%，含有MC3的配方在EE%和EEinput%之间表现出67%的差异，含有ALC-0315的配方表现出63%的差异。
图3. EE%与EEinput%的差异验证
进一步研究发现，改变总脂质浓度（0.5, 5, and 10 mM)，将增加EEinput%。总脂质浓度从0.5mM提升到10mM时，EEinput%从23%增加到82%。这些结果表明，即使可电离脂质与RNA的比率保持不变（60:1），使用较高的总脂质浓度也会增加LNP捕获的输入RNA的百分比。
多数LNP制剂需要使用至少10 mM的总脂质，并且通常实际生产中使用更高的浓度（50甚至60 mM）。然而，即使EE%和EEinput%在10 mM时开始接近，但仍在任意浓度下都存在差异，说明无法忽略总RNA输入浓度以验证获得的EE%值。通过考虑起始RNA浓度进行包封效率的计算，除了使传统EE%计算更符合原料、成本估计外，还阐明了有关LNP-mRNA合成效率的重要信息。这些附加信息可以为配方和工艺优化提供更明确、准确的参考。
RNA尺寸对包封后LNP性质的影响
包封效率（EEinput%）
采用EEinput%评估包封效率，所有研究测试的脂质制剂反映了RNA尺寸影响包封效率的显著趋势：较大的mRNA链比较短的RNA分子（10-100个碱基）能够更有效地包封。包封效率很大程度上取决于可电离脂质和带负电荷的RNA骨架之间的静电相互作用。较大的RNA分子具有较大的净电荷，可以更有效地与可电离脂质络合，从而产生更高的包封效率。短RNA序列（≤ 10个碱基）表现出更小的净负电荷，与较大的RNA适配体（~100个碱基），尤其是与mRNA分子（数百到数千个碱基）相比，具有明显的包封后形态差异。
在不同LNP配方中EEinput%呈现尺寸相关的递增趋势，ASO为16-23%，siRNA为25-33%，适配体为8-31%，mRNA为35-49%。其中ALC-0315和DSPC的组合在所有RNA分子中具有最高的EEinput%。
图4. 不同LNP-RNA配方中的EEinput%
纳米颗粒尺寸和多分散性
多分散系数（PDI）是表示样品中纳米颗粒粒径范围的归一化值，是反映样品质量的重要指标。在具有高分散性的样品中，分布中尺寸较大的颗粒往往会聚集和沉淀，从而导致有效RNA浓度降低和有效剂量改变。通常，为生物应用开发的LNP制剂的PDI应低于0.2，表明胶体是可接受的单分散体。纳米颗粒药物的单分散性对于确保预期药物的一致行为至关重要，尺寸会影响颗粒与身体的相互作用。
DLS粒径和多分散性分析表明，在高可电离脂质过量的情况下，RNA分子尺寸与LNP流体动力学直径之间没有显著相关性。这在一定程度上与已发表的文献一致，这些文献认为LNP大小主要受浓度、流速（对于使用微流控系统合成的颗粒）和PEG脂质浓度的影响。然而，有人猜测RNA分子尺寸和形态的差异可能会影响LNP尺寸。这是因为LNP中脂质和RNA的区室分布和结构因RNA大小而异。例如，具有最小二级结构（ASO、siRNA）的较小载物可能会在LNP核心中更密集地堆积。而具有复杂二级结构的较大RNA的分布密度较低，每个LNP内的RNA分子较少。普遍认为，这些形态差异在一定程度上可以合理地控制LNP直径。
然而，根据本研究，RNA分子尺寸和LNP尺寸之间没有明显的直接影响趋势。空载LNP通常比含有RNA的颗粒尺寸小，但也有例外，例如，装载有ASO、适配体和mRNA的MC3/DOPE LNP尺寸分别为105 nm、88 nm和102 nm，其中空载颗粒为120 nm。这进一步表明，LNP尺寸不是由搭载的RNA分子尺寸决定的，而是由混合参数和脂质组成决定的。实际生产中，使用较高的脂质浓度（>10 mM）和微流控快速混合已被证明可以将LNP的大小推到下限（低于100 nm和0.2 PDI）。这些结果支持了LNP尺寸主要由反应条件决定的观点，并表明RNA分子尺寸对纳米颗粒整体几乎没有影响。
以不同的LNP配方为例，含有DOPE的LNP表现出最高的多分散性（0.23），而含有DSPC的制剂表现出最低的分散性，为0.15。另一方面，ALC-0315是一种相对较大的分子，具有更坚硬的脂质尾部（支链、饱和），表现出更大的横截面，而MC3具有更小、更具流动性的脂质尾部（不饱和、无分支），ALC-0315制备的LNP尺寸将比用MC3制成的LNP大，ALC-0315制备的LNP平均尺寸为~133 nm，其中MC3产生~117 nm大小的LNP。当其他影响LNP尺寸大小的方法（脂质浓度或流速）不可行时，可以利用这些差异来增加或减少LNP大小，以符合应用场景。
总结
传统的EE%计算方法没有反映出制备过程中整体的RNA损失，从工艺优化和制造的角度来看，正确体现这些信息很重要。从大规模生产的角度来看，引入总起始RNA浓度有利于分析合成效率以及RNA原料损耗，将有助于基于成本效益设计更佳的LNP制剂。此外，研究发现RNA分子尺寸对纳米颗粒整体几乎没有影响，仅与脂质浓度，制备流速以及配方组分有关，对LNP粒径的优化需要关注这些差异进行设计。
参考资料
Schober, G.B., Story, S. & Arya, D.P. A careful look at lipid nanoparticle characterization: analysis of benchmark formulations for encapsulation of RNA cargo size gradient. Sci Rep 14, 2403 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-52685-1
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