荧光的原理
荧光是一种光致发光的现象，当光照射到某些物质时，这些物质会发射出不同波长和强度的光线。当光照停止时，物质所发射的光线也会随之迅速消失，这种光线被称为荧光。
从微观角度分析，当物质分子受到光照射时，分子会在吸收光子能量时被激发，分子内的电子会从低能级跃迁到高能级，此时分子从基态跃迁至激发态。而处于激发态的分子是不稳定的，会通过辐射跃迁或非辐射跃迁的衰变过程返回至基态，辐射跃迁的过程会产生荧光。分子内的激发和衰变过程如图1 所示。分子吸收能量发生跃迁时，若是从 S0 跃迁至 S1，由于 S1 的不稳定会通过辐射跃迁或非辐射跃迁返回至基态，其中辐射跃迁的衰变过程伴随着光子的发射，即产生荧光或磷光。
图1分子间的激发与衰变的过程
荧光光谱分析技术
荧光光谱可以反映目标分子的特性，可对目标分子定性或定量检测。随着仪器设备的进步，除了原有的常规荧光分析法之外，时间分辨荧光光谱分析法、同步荧光光谱分析法，三维荧光分析法等新的分析法得到了发展和应用。
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常规荧光分析法
常规荧光分析法一般指二维荧光光谱。二维荧光光谱主要包括荧光发射光谱和激发光谱。荧光发射光谱是固定入射波长对物质进行激发，检测物质荧光强度随发射波长的分布。荧光激发光谱是固定发射波长检测不同波长的入射光对物质激发后的荧光强度随激发波长的分布。
图2室温下菲的乙醇溶液的激发光谱和荧(磷)光光谱
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时间分辨荧光光谱分析法
时间分辨荧光光谱是指在脉冲光激发时，某一波长下的荧光强度随时间的分布的光谱图，再通过指数拟合时间分辨荧光光谱可以得到待测物的荧光寿命。荧光寿命的测量和荧光寿命成像的测量主要有时间相关单光子计数法(time correlated single photon counting, TCSPC)、门控探测法(time-gated detection)、条纹相机测量法(streak-FLIM)、频闪技术等四种常见的方法。激发光源波长为 374.2 nm 和探测波长为 535 nm 时，核黄素的时间分辨荧光光谱如图3所示。
图3核黄素的时间分辨荧光光谱
与荧光发射光谱相比，时间分辨荧光光谱具有不易受荧光分子浓度的影响、不易受激发光功率或者激发波长的影响和不同个体的光谱可以直接比较的优势。这些特性使得它对于各组分荧光光谱重叠的混合物的分析有着独特的优势，可以通过比较时间分辨荧光光谱差异实现混合物中组分的痕量分析。
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同步荧光光谱分析法
同步荧光分析由Lloyd首先提出，它与常用荧光测定最大的区别是同时扫描激发和发射两个单色器波长，他们之间的区别可见图4。由测得的荧光强度信号与对应的激发波长(或发射波长)构成光谱图，即同步荧光光谱。
图4 发射光谱、激发光谱、同步光谱的区别
图5某池塘水样的恒波长同步荧光光谱
按光谱扫描方式的不同，同步荧光分析可以分为恒(固定)波长法、恒能量法、可变角法和恒基体法。同步荧光光谱与激发光谱及发射光谱都有关系，它同时利用了化合物的吸收特性和发射特性，因而使光谱分析的选择性得到改善;同步荧光光谱可以把强带增强而减小弱带的干扰，因此可消除Raylei干扰，使Roman强度降低且拉宽。非常适合多组分混合物的分析，在环境、药物、临床、化工等领域应用广泛。
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三维荧光分析法
三维荧光光谱是近几十年中发展起来的一种新荧光技术。普通荧光分析所得的光谱是二维谱图，包括固定激发波长而扫描发射波长所获得的发射光谱，和固定发射波长而扫描激发波长所获得的激发光谱。但是实际上荧光强度应该是激发和发射这两个波长变量的函数。描述荧光强度同时随激发和发射波长变化的关系谱图，就是三维荧光光谱。它可以提供比常规荧光光谱和同步荧光光谱更为完整的光谱信息，是很有价值的光谱指纹技术。在一个多组分体系的三维荧光光谱中，每种组分有独立吸收和发射的特定光谱区，可以通过一次扫描便有可能检测体系中的全部组分。
图6对照和施用化肥处理下土壤DOM的三维荧光光谱图
三维荧光光谱可以作为光谱指纹技术在环境监测(溶解有机质的分布等)、临床化学(根据癌细胞荧光代谢产物的检测，区分癌与非癌细胞等)以及细菌鉴别等领域应用;也可用于光化学反应监测、多组分混合物的定性和定量分析等。
荧光分析技术的应用场景
荧光分析是一种先进的分析方法，它比电子探针法、质谱法、光谱法、极谱法等都应用的较广泛和普及，这同荧光分析具有很多优点分不开的。荧光分析所用的设备较简单比起质谱仪、极谱仪和电子探针仪来它在造价上要便宜很多倍，而且荧光分析的最大特点是：分析灵敏度高、选择性强和使用简便。
图7荧光光谱的应用
荧光光谱已应用于很多不同领域，特别是需要无损、显微、化学分析、成像分析的场合。无论是需要定性还是定量的数据，荧光分析都能快速、简便地提供重要信息。在生物领域，主要用于临床测定生物样品中某些成分的含量，生物技术及免疫技术的分析等，其中纳米技术的兴起，打开了荧光分析的又一个新的领域。在食品领域，该领域主要用于食品中矿物质及金属元素、微生物、菌类污染、添加剂、防腐剂、食品包装有害物质、农药残留等的分析检测。在药物分析，药物分析领域可以利用荧光分析进行药物的有效成分鉴定、药物代谢动力学研究、临床药理药效分析等。在环境分析，该领域主要利用荧光分析检测环境中的物质的含量，主要是对水体、矿石和土壤进行检测。
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