导读：猫传染性腹膜炎（FIP），简称猫传腹，是由猫冠状病毒（FCoV）感染引起的传染性疾病。FCoV感染在世界各地呈地方性流行，尤其在多猫家庭中非常普遍，任何品种或年龄的猫均有患病风险。有研究表明家养单只猫感染率在20%～60%之间，群体猫的FCoV血清阳性率接近90%，对宠物行业和伴侣动物家庭造成较大的伤害。
控制FCoV感染最有效的方式是疫苗接种。然而目前仅有一款活疫苗在部分国家获批上市，即辉瑞的Felocell FIP（Primucell）。随着mRNA疫苗技术的快速发展，以及对FCoV病毒结构、关键抗原的深入了解，关于FIP mRNA疫苗（也称FCoV mRNA疫苗）的探索也取得可观结果。
FCoV病毒结构、抗原组成、关键抗原，以及mRNA技术在FCoV疫苗开发中的最新应用。
01
病毒组成及临床特征
FIP是一种由FCoV引起的全身性、致死性免疫介导性疾病，以纤维蛋白性或肉芽肿性浆膜炎为特征，FIP基于腹腔和胸膜腔中是否存在富含蛋白质的积液，可分为湿性（渗出性），干性（非渗出性）以及这两种混合形式的FIP。
1.1 FCoV病毒组成与关键抗原
FCoV是一种有囊膜、不分节段的单股正链RNA病毒，属尼多病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属。其基因组大小约为29kb，由11个开放阅读框（ORFs）组成：主要的两个ORFs编码一个复制酶多聚体；四个ORFs编码结构蛋白，分别是S蛋白（刺突蛋白）、E蛋白（包膜蛋白）、M蛋白（膜蛋白）和N蛋白（核衣壳蛋白）；其余五个ORFs编码非结构蛋白3a、3b、3c、7a和7b。
其中S蛋白包含用于受体结合的亚基（S1）和介导膜融合亚基（S2），是产生中和抗体的主要蛋白，也在病毒和受体结合及入侵宿主过程中发挥重要作用。因此，编码S蛋白及其片段的mRNA疫苗是有效的预防猫传染性腹膜炎的举措。
图1 猫冠状病毒FCoV结构和基因组示意图
1.2 病毒的血清型
FCoV根据S蛋白氨基酸序列和抗体交叉中和差异分为两种血清型：Ⅰ型和Ⅱ型。II型FCoV临床不常见，由犬冠状病毒(CCoV)和FCoV双重重组而来，多数体外分离和培养的FCoV毒株为FCoV-II型，而临床流行更广的I型FCoV难以分离，严重阻碍了对FCoV的体外研究。
1.3 临床症状
渗出型FIP：最明显的临床症状是腹腔肿大，触摸有水样波动感；此外还有发烧、精神萎靡、食欲下降、体态消瘦、腹泻等明显表征；还会出现呼吸困难、贫血等症状，公猫出现阴囊增大情况。
非渗出型FIP：表现为食欲下降、精神萎靡、体态消瘦和腹泻。腹部没有肿大现象，区别于渗出型FIP的是病例常伴有眼部疾病如角膜水肿、混沌,眼房出血，眼前房蓄脓，缩瞳和视力下降等症状，这也是非渗出型FIP最显著的病理表征。少数病例还伴随着神经性病变，出现共济失调、轻度瘫痪等行为改变和定向力障碍。
02
治疗及预防
2.1 治疗
（1）抑制免疫反应：因FIP为一种免疫介质疾病，可使用皮质类胆固醇抑制免疫反应，该疗法是未出现可抑制FCoV复制药物之前唯一的选择，当病变是局灶性的且局限于单个组织时，皮质类胆固醇是最有效的。
（2）抑制FCoV复制：目前常用的药物有GC376和 GS-441。GC376是一种抑制病毒蛋白酶活性的化合物；GS-441是一种核苷类似物，通过在复制的病毒RNA中插入一个无义腺嘌呤来阻止FIPV病毒的复制；另外两种核苷类似物EIDD-1931、EIDD-2801(莫努匹韦)也已被证明可用于治疗FIP。
2.2 预防（疫苗）
抵御FCoV感染最有效的方式是疫苗接种，目前只有辉瑞公司研发的一种经鼻给药的FIP疫苗（Felocell® FIP）上市，但仅在部分国家实现了商业化。因此，针对FIP的疫苗开发研究从未停止。
03
猫传腹（FIP）mRNA疫苗的开发
3.1 四川吉星动物药业FIP mRNA疫苗
四川吉星动物药业在发明专利（CN202310500094.8）中公开一种用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA及疫苗，其中mRNA包含编码引起猫传染性腹膜炎的血清Ⅰ型猫冠状病毒UCD1和FIPV-UU4系列毒株及其变体的S蛋白或S蛋白的至少一个片段（包含受体结合区序列）。
mRNA合成质粒元件：按CMV启动子序列、T7启动子序列、5''UTR区、优化的表达抗原蛋白的基因序列、3''UTR区、3''末端Poly(A)尾和bGH Poly(A)信号序列顺序构建于pVAX-1克隆载体，其中还含BglⅡ限制性内切酶位点。
图2 pVAX1-FIPV质粒序列图
猫传腹(FIP) mRNA疫苗的体外合成：
（1）DNA模板制备：用限制性内切酶BglⅡ对合成质粒进行单酶切，酶切产物用苯酚或氯仿萃取及乙醇沉淀法纯化获得DNA模板；
（2）体外转录反应体系：1μg模板、2μL ATP(100mM)、2μL GTP(100mM)、2μL CTP(100mM)、2μL UTP(100mM)、2μL Enzyme Mix、2μL 10X Reaction Buffer，用Nuclease-free Water稀释至20μL，37℃反应2h，获得mRNA；
（3）模板消化：加入2μL DNase I后37℃反应15min；
（4）mRNA初次纯化：在体外转录反应液中加入1/2体积的LiCl沉淀溶液(7.5M)，混匀后于-20℃静置45min，15000rpm离心15min，用预冷的70％乙醇洗涤收集沉淀，室温静置待有机溶剂挥发，加入Nuclease-free Water复溶；
（5）mRNA加帽：取10ug RNA用DEPC水稀释至14.5μL，65℃加热5min，随后立即置于冰上5min；加入2μL 10X Capping Buffer，1μL GTP(10mM)，1μL SAM(4mM)，0.5μL RNase Inhibitor，1μL mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase，4μL Vaccinia Capping Enzyme，37℃反应1h；
（6）mRNA二次纯化：方法同初次纯化；后得到的编码全长S蛋白的mRNA（约4300bp）。
（7）mRNA-LNP制剂：将纯化的mRNA溶液用10mmol/L、pH4的柠檬酸缓冲液稀释至1mg/mL，得到微流控的水相（核酸）；L319、DSPC、胆固醇、PEG-DMG（摩尔比：55:10:32.5:2.5）溶于乙醇中，得终浓度为10mg/mL有机相（脂质）。使用注射器泵将水相和有机相（体积比：3:1）加样至PEEK高效液相色谱管，收集的流出液置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析过夜，后用0.2μm无菌滤头过滤，得mRNA脂质纳米粒溶液。
用动态光散射仪(DLS)检测制得的mRNA脂质纳米粒粒径分布为50-120nm，平均粒径115nm，PDI小于0.25。
猫传腹(FIP) mRNA疫苗的抗体效价：将分别编码全长S蛋白和S蛋白受体结合域的mRNA疫苗用于猫体内给药实验（低、中、高三个剂量组），每组给药一次，结果显示免疫接种后14天，猫体内产生了高滴度的猫传腹病毒中和抗体，与阴性组相比具有显著性差异，产生良好的保护效果。
综上，猫传腹(FIP) mRNA疫苗递送至动物体内后能够产生FCoV的S蛋白，以作为抗原触发有效保护性免疫应答。
图3 免疫接种后抗体效价结果
3.2 科牧丰生物FIP mRNA疫苗
更早的专利信息中（CN202210001302.5），北京科牧丰生物/南京兆丰华生物公开了一种用于预防猫传染性腹膜炎的mRNA疫苗，所述编码猫冠状病毒抗原的mRNA含有编码FCoV病毒的S蛋白和E蛋白中的至少一个蛋白，和/或，至少一个蛋白片段的编码区。
上述抗原蛋白的氨基酸序列可来源于如下毒株：FCoV WSU791146、Feline coronavirus isolate 79-1146、Feline infectious peritonitis virus strain DF-2、Feline infectious peritonitis virus isolate HRB/XF17、Feline coronavirus strain WSU 79-1683、FCoV/China/SMU-CD59/2018、FCoV/NTU156/P/2007、FCoV/China/SMU-CD61/2018、FCoV/China/SMU-CQ18/2018、FCoV/China/SMU-CQ14/2018或Canine coronavirus strain 171。
猫传腹(FIP) mRNA疫苗的序列特征：含有5''-帽结构（ARCA、m7G(5)ppp(5) (2''OMeA)pG、m7G(5)ppp(5) (2''OMeG)pG、m7(3''OMeG)(5'')ppp(5'')(2''OMeG)pG、m7(3''OMeG)(5'')ppp(5'')(2''OMeA)pG、mCAP、dmCAP、tmCAP或dmCAP）、3''-末端Poly(A)尾（50-250个A）、5''UTR（猫DNAH2 5''UTR序列或KOZAK序列）、3''UTR（猫血红蛋白HBB的3''-UTR序列或β-珠蛋白3''-UTR序列）及经过针对在猫内表达时的密码子偏好性优化和提高了GC含量的编码区，其中含有S蛋白全长、S蛋白的受体结合区（RBD）、E蛋白编码区的mRNA的长度分别为4794nt、1451nt、1265nt。
猫传腹 (FIP) mRNA疫苗的免疫效用：将含有编码S蛋白全长、S蛋白RBD和E蛋白的mRNA疫苗制剂用于猫给药实验（10μg、20μg、40μg、100μg组mRNA），给药后14天通过中和法检测猫体内所产生抗体效价，结果发现含有S蛋白全长和RBD的mRNA的疫苗能有效触发机体的免疫反应，产生较高水平抗体。
图4 三种mRNA疫苗不同剂量接种猫抗体检测结果
04
总结
mRNA疫苗具有较高的有效保护率，因其仅在动物细胞质中进行翻译，而不进入细胞核，相较于其他创新型疫苗（如DNA疫苗、病毒载体疫苗）具有更高的安全性；此外，与传统的重组蛋白疫苗、灭活疫苗和减毒疫苗相比，mRNA疫苗具有制备、纯化方式简单、接种次数少、易普及、应用前景佳等优势，对预防猫传染性腹膜炎具有重大意义。
参考文献
[1] 张凌，韩剑锋，屈梦珂，黄诗琪，苏勇. 用于预防猫传腹的猫冠状病毒mRNA,疫苗,mRNA制备方法及应用[P]. CN116515866A.
[2] 刘昊，张静，王海燕，汤波，聂思静. 一种用于预防猫传染性腹膜炎的mRNA疫苗及其制备方法[P]. CN202210001302.5.
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