| 实验步骤 |
材料与设备
纯化的鼠肝细胞质膜（见本单元实验 1)
部分纯化的胰岛素受体，得自 WGA-琼脂糖柱层析（见实验本单元 3)
純化的胰岛素受体，得自胰岛素琼脂糖柱层析（见实验本单元 4)
猪胰岛素〔17,5pmol/L(0.1 mg/ml)，溶于 0.001mol/LHCl〕(如 Sigma Chemical Co.13505)
ATP(20 mmol/L;pH7.4)
蛋白质凝胶电泳装置（Bio-Rad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)
Whatman 3 MM 滤纸
硝酸纤维素膜（Schleicher and Schuell,Inc.)
电泳转移槽（Bio-Rad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)
一抗（抗磷酸酪氨酸抗体）（单克隆 IgG 2bk;Upstate Biotechnology,Inc.05-321)
二抗〔辣根过氧化物酶（HRP) 标记的抗鼠 IgG;Bio Rad Laboratories〕
ECLTM免疫印迹检测试剂盒（Amersham Life Science,Inc.)
试剂
自磷酸化缓冲液（10x)
起始溶液（10x)
SDS-PAGE 样品缓冲液（5x)
蛋白质印迹转移液
封闭缓冲液
Tris-HCl(10 mmol/L；pH7.4)
NaCl(150 mmol/L)
Tween-20(0.1%)(TBST)
(配方, 见 试剂的配制，pp.234~240)
操作程序
自磷酸化作用
1) 配制如下混合液:
2) 混合液室温孵育 15 min。
3) 加 2ul 20 mmol/LATP 和 4ul 10X 起始溶液，开始磷酸化反应。混合后置室温
解育 15 min。
4) 加 10ul 5xSDS-PAGE 样品缓冲液终止反应。
5) 样品煮沸 5 min。
6) 样品加载于 7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，170V 电压下电泳，至染料前沿离开凝胶。（关于 SDS-PAGE 的进一步资料，见附录 5)
将蛋白质转移至硝酸纤维素膜
1) 于凝胶夹的一侧，先放一纤维热（fiber pad), 其上再放一张湿的 Whatman 3 MM 滤纸。
2) 将凝胶放在滤纸的上面。
3) 用水湿润一张硝酸纤维素膜后，将它盖在凝胶上。除去滤纸和凝胶之间的气泡。
4) 再在硝酸纤维素膜的上面放一张湿润的 Whatman 3 MM 滤纸
5) 再铺上另一纤维垫，制成 三明治。
6) 合上凝胶夹。
7) 将凝胶夹放入缓冲液槽中，硝酸纤维素膜面对槽的阳极侧。上述 三明治 应按如下方式排列：
阴极（黑色）
纤维垫
3 MM 滤纸
凝胶
硝酸纤维素膜
3 MM 滤纸
纤维垫
阳极（红色）
8) 槽中充满蛋白质印迹转移液。
9) 置冷室，于 100V 电压下，电泳转移 2 h。
蛋白质印迹
1) 置硝酸纤维素膜于封闭缓冲液中，37℃孵育 1 h。
2) 将硝酸纤维素膜放于有足够量的含一抗（10000 倍稀释的抗磷酸酪氨酸抗体) 的 TBST 液的托盘中，保持膜湿润确保硝酸纤维素膜面对凝胶的那一面向上。
3) 在室温下，摇摆托盘 1~2 h。
4) 用 5 ml TBST 液洗硝酸纤维素膜 5 min。重复 4 次。
5) 加入足够量的二抗（5000 倍稀释的辣根过氧化物酶结合的抗鼠 IgG), 保持硝酸纤维素膜湿润。
6) 置室温孵育 1 h。
7) 用 5 mlTEST 液洗硝酸纤维素膜 5 min, 重复 4 次。
8) 取 ECL 蛋白质印迹试剂盒中的试剂 1 和试剂 2, 等量混合，配制化学发光测定液。
9) 将化学发光测定液倒在硝酸纤维素膜上，反应 1 min。
10) 立即排去多余的试剂。
11) 将硝酸纤维素膜置塑料包装膜内。
12) 加磷光定位斑点（phosphorescentorientationdot)。
注：此步操作时，用 Polymark Natural Glow No. PM 501 很好使，它可在手工艺品商店买到。
13）蛋白质印迹膜曝光 5s、1min 或更长一些时间，直至得到所需的结果。 |
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