待标记的培养细胞

37℃标记培养液 1 Ci／ml H3(32)PO4(溶于 HCl) 冰冷 Tris 平衡盐水(TBS) ／磷酸盐平衡盐水(PBS) 温和裂解缓冲液／RIPA 裂解缓冲液

树脂玻璃挡板(1 in 厚) 取液器吸头 树脂玻璃盒 37℃微量离心管 一次性吸管 橡皮细胞刮子 Sorvall 冷冻离心机(或其他) 树脂玻璃薄板／4℃ 树脂玻璃管架

实验试剂仪器的具体要求见「其他」。

1. 培养待标记的细胞至适当的生长期。

生长旺盛的细胞中磷酸盐转运达到最高峰，除非研究静止期细胞的蛋白质磷酸化，一般待标记的细胞生长密度不要达到汇片，标记前 3～18 h 换新鲜的培养液培养将有利于标记。

2. 吸去培养液，用 37℃ 的含血清不加标记物的标记培养液洗尽残存的含磷酸盐的培养液，吸尽该培养液。

3. 加入预热的标记培养液，加入量为：（0.5～1 ml）/35 mm 培养皿，（1～2 ml）/50 mm 培养皿，或（2～4 ml）/100 mm 培养皿。

4. 在树脂玻璃挡板后操作，使用配备塞有棉花防浮质吸管的微量移液器加入 ³²P 至终浓度为 0.1～2 mCi/ml。

标记 1～2 h 已足够，但细胞可在 6 h 内耐受高达 2 mCi/ml 和在 18 h 内耐受低浓度（0.1～0.5 mCi/ml）的辐射。

5. 将培养皿置于预热的树脂玻璃盒中，并将盒子置于培养箱中。

6. 标记结束时，将装有标记细胞的树脂玻璃盒移至冷室，放在树脂玻璃挡板后面。

7. 从树脂玻璃盒子中取出培养皿，用一次性的移液管吸尽标记培养液，培养液和吸头或吸管均作为同位素废物弃置。

8. 用 2～10 ml 冷 TBS 洗涤细胞 2 次，同步骤 7 一样吸尽并弃去放射性废物。

9. 加适量裂解缓冲液（0.3 ml/35 mm 培养皿，0.6 ml/50 mm 培养皿或 1.0 ml/ 100 mm 培养皿），用橡皮细胞刮子擦刮下贴壁细胞，裂解物留在培养皿上，4℃ 放置 20 min。用橡皮细胞刮子将贴壁细胞的裂解液移至培养皿边缘，并将裂解液移入带螺口盖的微量离心管中。

10. 盖上管盖，于 4℃ 26000 g 离心 30 min 澄清裂解液。

11. 离心后，将上清（裂解物）移至新离心管中，离心管和沉淀作为同位素污物处理。

12. 用凝胶电泳、免疫沉淀或蛋白质纯化方法，分析标记的裂解液，所有过程均在4℃ 适当屏蔽下进行。

1. 除非特别说明，细胞培养在加湿的 37℃，10% CO₂ 培养箱中进行。

2. 步骤 7 中，不能用真空泵吸标记培养液。真空泵抽吸会产生放射性气溶胶并在仪器中留下放射性薄层。继续 Plexiglas 挡板后处理细胞和裂解。

3. 步骤 9 中，如果需要降低由非特异性杂质造成非特异性的背景，可使用 RIPA 裂解缓冲液。如果要求保持酶 的活性或蛋白质复合物的结构，使用含 CHAPS （3-胆酰胺丙基-二乙胺丙磺酚）或  Nonidet P-40 （乙基苯基聚二乙醇，即 NP-40）作为唯一去污剂的温和裂解缓冲液。要完全溶解细胞和使蛋白质变性，使用SDS裂解方法。

4.  步骤 10 中管内液体最好是装至半满以防液体溅出。

用 RIPA 缓冲液制备裂解液时，由于细胞核的溶解常导致细胞裂解液变得黏稠。当发生这种情况 时，延长离心时间到 90 min，或离心前在 RIPA 液中加入 50 μl 固相化金黄色葡萄球菌，都可使 DNA 沉于管底。

试剂：

标记培养液：不含磷酸盐的细胞培养液 （如 DMEM），添加了常规浓度的血清或用无磷酸盐的盐水透析过的血清，37℃

溶于 HCl 中的 1 Ci/ml H₃³²PO₄ （无载体，ICN）

Tris 平衡盐水（TBS） 或磷酸盐平衡盐水（PBS），冰冷

温和裂解缓冲液或 RIPA 裂解缓冲液

仪器：

1 in 厚的树脂玻璃挡板

塞有滤芯的防浮质的取液器吸头

树脂玻璃盒，预热到 37℃

带螺口盖的微量离心管

一次性的吸管（塞有棉花）

橡皮细胞刮子

Sorvall 冷冻离心机，带 SM 24 转子和橡皮套管，或其他相当的冷冻离心机，4℃

树脂玻璃薄板 （10 in × 10 in × 1/4 in） 或树脂玻璃管架，4℃