图1. 蛋白混合酶解产物的LC-MS/MS 离子色谱图，反相分离时间为90min。
质谱技术在蛋白质组学研究中扮演着非常重要的角色。高分辨率、高质量精度的质谱仪能够降低实验中误差，增加实验数据的准确性。
蛋白质鉴定是蛋白质组学研究的核心所在，而质谱技术在蛋白质组学中扮演着非常重要的角色。
shotgun策略是一种鉴定蛋白质混合物的方法，它越来越广泛地应用于蛋白质组学的研究中，而在shotgun技术的应用过程中，质谱的性能是非常重要的一个组成部分，高分辨率、高质量精度的质谱仪能够降低实验中误差，增加实验数据的准确性。
本实验就是运用shotgun技术分析一些已知蛋白质肽段的混合物，以此来对Thermo公司的LTQ-Orbitrap质谱仪的分辨率、质量精度等相关性能进行测试，从而对LTQ-Orbitrap质谱仪用于肽段的鉴定进行评价。
材料与方法
材料
19 种标准蛋白的混合物，包括BSA、 Cytochrome C、Thyroglobulin、Myoglobin、Transferrin 等来自猪、马等动物的蛋白。
蛋白酶解
将这19种蛋白按照标准的实验步骤进行酶解。简述如下，将蛋白混合物用6M 盐酸胍进行变性，然后用DTT 将其二硫键进行还原，再加入IAA进行烷基化反应；然后将蛋白质混合物置于100mM 碳酸氢铵溶液（pH8.5）中，最后加人适量胰蛋白酶于37℃酶解20hr。
LC-MS/MS 分析
蛋白质酶解混合物反相分离在一台Surveyor LC上进行，分析柱为75µm x 150mm的C18反相柱，流动相分别为含0.1%FA的水和乙腈溶液，流速为300nl/min，反相梯度为50min内乙睛与水的比例从2%升高到40%。
图2. A是在Orbitrap上的洗脱时间为42.97min 时的Full MS扫描图谱，显示了在此时间点的肽段混合物。Orbitrap的扫描分辨率设置为60000 (m/z=400)；B-D是三个标记不同的m/z的放大，显示了其峰型、分辨率和电荷数。
肽段的鉴定在LTQ-Orbitrap质谱仪上进行，质谱分析模式为一个在Orbitrap中的Full MS 扫描后加上三个在Full MS扫描中最高强度的离子在LTQ中进行的MS2扫描和一个在Full MS 扫描中最高强度的离子在Orbitrap中的MS2扫描。其中Orbitrap中的MS2扫描分辨率设置为60000(m/z=400)。其中Orbitrap中的Full MS扫描和三个LTQ 进行的MS2扫描是同步进行，大约花费的时间为ls，而Orbitrap中MS2扫描时间大约为0.3s，整个5次扫描花费的时间为1.3s。另外，在质谱分析的过程中使用了动态排除模式，每个m/z只做两次MS2扫描。
数据库搜索
将19种标准蛋白的Swiss-Prot数据库中的蛋白序列提取出来，然后将19种蛋白序列反转得到19种相反的氨基酸序列，最后与原始序列一块形成一个含38个氨基酸序列的fasta文件的正反数据库。
图3. A是Orbitrap在反相洗脱时间为46.81min 时检测到的Full MS 质谱图中m /
z为677.80597的放大图，经MS / MS分析该序列为NYELLCGDNTR。B是该母离子在LTQ 中的MS
/MS图，C是该母离子在Orbitrap中MS2扫描分辨率设置为7500 ( m/z= 400）的MS / MS 图。
SEQUEST进行数据库搜索时mass tolerance设置为0.01Da，所有残基不加可变修饰，半胱氨酸残基加上固定修饰为57.02146Da。最后通过XCorr和ΔCn使结果错误率控制在1%以下。
结果和讨论
整个实验过程中，LTQ-Orbitrap Full MS扫描设置的分辨率为60000 (m/z=400) , Mass range 为400~1800。图1显示了整个分离过程中质谱检测的色谱图。图2A显示了反相洗脱时间为第42.97min时检测到的Full MS质谱图。图2B显示低m/z的单同位素峰452.55859的分辨率为62601。图2C显示中等m /z的单同位素峰678.33392的分辨率为51501。图2D显示高m/z的单同位素峰1031.41724 的分辨率为42301。很明显，质量分辨率随着m/z增加而降低，但是高m/z的分辨率还是非常令人满意的。
表1. 蛋白酶解后用质谱鉴定到的部分肽段
表1显示了部分肽段的鉴定结果，结果显示鉴定到的肽段的质量精度非常高，检测到的质量与理论质量相差非常小，最低差异为0.000lDa，最高的差异为0.0032Da ,这个结果说明了LTQ-Orbitrap质量扫描非常准确，也证明我们鉴定结果的可靠性。
我们还对LTQ 做的MS/MS结果与Orbitrap做的MS/MS结果进行了比较。图3A显示了序列为NYELLCGDNTR,其母离子m/z单同位素为677.80597 的Full MS质谱图，其分辨率为51701，将其换算成一价离子分子量为1354.6065Da，而该序列的理论一价离子分子量为1354.6056Da，检测到的质量与理论质量只相差0.0009Da或0.6644ppm。图3B和图3C是NYELLCGDNTR肽段分别在LTQ中和Orbitrap中的MS/MS图，很明显这两次MS2扫描中高丰度的离子碎片是完全一样的，鉴定结果中图3B和图3C都找到了理论的20个b/y离子中的17个，而且这两次MS/ MS找到的17个b/y离子完全一样。这个结果说明了离子在从LTQ 往Orbitrap的传输过程中，其离子的相对丰度是不变的。而Orbitrap 中的MS/ MS的离子碎片的质量精度和分辨率都非常好，这对于de novo 测序应该非常有帮助。
结论
很明显，使用LTQ-Orbitrap分析肽段混合物可以得到高质量的肽段数据。Orbitrap的分辨率能够达到40000~60000，而且检测到的离子质量与离子的理论质量相差非常小。LTQ -Orbitrap的这些特点有助于提高结果数据的准确度，降低数据中的假阳性。
LTQ-Orbitrap具有扫描速度快、分辨率高和质量精度高的优点，这些优点非常适合于bottom -up方式的蛋白质学研究。LTQ
和Orbitrap具有相似度较高的MS/MS图，但是Orbitrap得到的MS/MS碎片离子的分辨率更高，质量精度更准确，这将极大地提高序列分析中的准确度。
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