引言反相HPLC已成为分离和分析蛋白质和多肽的重要工具。
它在生物技术行业中被广泛应用于蛋白质类治疗产品的表征，以及这些产品和杂质的鉴定。
在通过质谱鉴定蛋白质之前，反相HPLC在从消化后的蛋白质组中分离多肽方面有着至关重要的作用。
它也被用于探索性研究中多种蛋白质和多肽的纯化，以及蛋白类治疗药物的大规模纯化。
反相HPLC灵敏、通用性强，还可与质谱等技术结合使用，在蛋白质研究中具有重要的地位。
此外，它还能够分离结构近乎相同的蛋白质，因而得到了广泛的应用。
正如牛、人和猪胰岛素变异体的分离过程所示（图1），反相HPLC能够分离非常相似的蛋白质。
牛胰岛素和人胰岛素仅有三个氨基酸的差别，也能够被完全分离开来。
牛胰岛素在胰岛素“a”链的第8位为丙氨酸，第10位为缬氨酸，“b”链的第30位为丙氨酸。
而人胰岛素在胰岛素“a”链的第8位为苏氨酸，第10位为异亮氨酸，“b”链的第30位为苏氨酸。
图1. 以RP-HPLC对紧密关联的胰岛素变异体进行分离
条件 色谱柱：ACE 5 C18,4.6 x 250mm 洗脱液：含有29.3 - 31.7% 乙腈的 0.1% 三氟乙酸溶液，以1.0毫升/分钟的速率洗脱至少16分钟 样品：牛、人和猪胰岛素 |
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猪胰岛素和人胰岛素仅有一个氨基酸的差异（猪胰岛素的“b”链第30位为丙氨酸，人胰岛素该位置为苏氨酸），在基线即已分离。
在另一个实例中，尽管兔胰岛素和人胰岛素仅有一个氨基酸的差异，即以苏氨酸取代了丝氨酸，但也同样得到了分离（参考文献1）。
反相HPLC的高分离能力也被扩展应用到了多肽上。
在图2中，两种多肽尽管只有一个氨基酸的差异，即丝氨酸对苏氨酸，但也得到了完全的分离。
这种高分离能力是反相HPLC在蛋白质和多肽分离中得到广泛应用的基础性因素。
图2. 以RP-HPLC对紧密关联的多肽进行分离。仅有一个氨基酸不同的两种十肽菌素，一种含丝氨酸，而另一种含苏氨酸。
| 条件 色谱柱：C18 宽孔柱， 4.6 x 250 毫米 洗脱液： A. 含有0.1%三氟乙酸的水溶液 B. 含有0.08%三氟乙酸的乙腈溶液 梯度：0 - 35%的B溶液超过73分钟（参考文献2） |
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蛋白质/多肽的保留机制
在反相HPLC中，颗粒表面是十分疏水的，因为其表面通过化学连接有羟基（图3中的波浪形红线）。
通过疏水表面对蛋白质一面（被称为“疏水性足”）的吸附，蛋白质被保留下来（图3）。
与疏水表面的厚度相比，蛋白质要大得多，因此蛋白质仅有一部分被疏水表面所吸附。
大部分蛋白质位于表面上方并与流动相接触。
由这种疏水性吸附所导致的净相互作用非常强，会导致蛋白质保持吸附在表面上（图4A），直至接触到特定浓度的有机溶剂，这时蛋白质会从表面上解吸附并从色谱柱上洗脱（图4B）。
在最初的吸附/解吸附之后，尽管蛋白质在从色谱柱上移动下来时仍会与表面产生一些相互作用，但却是十分微弱的，对分离过程无影响。
分离是由单次吸附/解吸附过程完成的。
解吸蛋白质所需要的有机改性剂的浓度十分精确，并与疏水足的大小呈函数关系。
详情请参阅参考文献3。
图4. 进入色谱柱的蛋白质被吸附在柱顶端附近的疏水表面上（A）并且一直保持吸附，直至有机改性剂的浓度达到特定值，此时蛋白质从表面解吸附（B）。
在反相HPLC中，吸附/解吸保留机制导致蛋白质的保留行为与小分子不同。
小分子的保留行为随着有机溶剂浓度的改变而缓慢改变时（图5，联苯），一旦有机溶剂的浓度达到所需要的值，蛋白质的保留行为即发生突然改变，引起保留时间的快速变化（图5，蛋白质）。
该过程产生的尖锐峰形常见于蛋白质和多肽（图6A）。
由于有机溶剂浓度的微小变化会引起的显著的保留行为变化，等度洗脱很少被用于蛋白质中，因为峰变宽了，而有机溶剂的微小改变会导致蛋白质保留行为的巨大变化（图6B）。
图5.有机溶剂浓度对应的保留行为
图6.
A. 梯度洗脱过程中多肽和蛋白质洗脱出尖锐峰形。
B. 等度洗脱下，蛋白质的峰形（本例中为溶菌酶）很宽，有机溶剂的微小改变都会引起保留时间的巨大变化。
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