二苯胺DNA比色法定量测定试剂盒使用说明

主要用途

二苯胺DNA比色法定量测定试剂是一种旨在通过二苯胺与DNA的特异性结合反应，借助可见光波长的吸光峰值的变化，比色测定样品中DNA的绝对含量或浓度的技术方法。其适用于各种原核生物和真核生物的细胞或组织DNA以及环境中DNA含量分析。产品即到即用，性能稳定，简易方便，无需样品纯化，定量准确。

技术背景

二苯胺（diphenylamine）具有与DNA酸性水解脱嘌呤后释放的脱氧核糖（deoxyribose）转变的ω-羟基菊芋糖醛（ω-hydroxylevulinyl aldehyde）特异性反应的功能，形成蓝色复合物。但不与RNA的核糖 （ribose）反应。通过可见光（600nm）吸收可以进行定量分析。因此避免了A260测定的种种限制，例如对样品的纯化要求、对DNA的单链双链的要求和对紫外光UV的需求，以及RNA的干扰。

产品内容

缓冲液（Reagent A）  8毫升

分解液（Reagent B）  8毫升

反应液（Reagent C） 25毫升

稳定液（Reagent D）     125微升

标准液（Reagent E）       200微升

产品说明书                     1份

保存方式

保存稳定液（Reagent D）和标准液（Reagent E）在4℃冰箱里，其余的保存在室温下；其中反应液（Reagent C）和稳定液（Reagent D），具有腐蚀性，注意操作安全，且避免光照，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

恒温水槽：用于反应物孵育

比色皿：用于比色分析的容器

分光光度仪：用于样品比色测定

实验步骤

• 测定准备

• 准备好待测样品，置于冰槽里

• 设定好分光光度仪：波长600nm，并置零

• 准备好9个1.5毫升离心管，标记为1至9号管

• 按照下表配制标准液

• 放进冰槽里备用，避免光照
  

二、比色测定

实验开始前，小心移取6毫升反应液（Reagent C）和30微升稳定液（Reagent D）到15毫升锥形离心管，混匀后，标记为反应工作液，避免光照。然后进行下列操作。

• 准备至少10个新的1.5毫升离心管作为测定管：标记9个标准管和1个待测样品管

• 分别加入140微升缓冲液（Reagent A）到每一个标准管和样品管

• 分别加入10微升上述配制的标准液（Reagent E）到相应测定管里（注意：浓度和管号对号入座）

• 加入10微升待测样品到样品管里

• 分别加入150微升分解液（Reagent B）到所有测定管里

• 放进70℃干式恒温槽或恒温水槽孵育20分钟

• 在室温下静置，直至试管温度降温到室温（15至30分钟）

• 分别加入600微升含有反应液（Reagent C）和稳定液（Reagent D）的反应工作液到所有测定管里

• 放进37℃培养箱（暗室环境）孵育5小时

• 即刻分别移入到1毫升比色皿，放进分光光度仪读数：获得吸光读数

• 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（OD）；横座标（X轴）为标准DNA浓度（微克/10微升）

• 根据标准曲线获得样品对应DNA浓度（微克/10微升）

• 样品实际DNA浓度：
  

[根据标准曲线获得样品对应DNA浓度（微克/10微升）X样品稀释倍数]÷100＝微克/毫升

注意事项

• 本产品为10次样本操作

• 操作时，须戴手套

• 系统操作时，标准样品测定只需1次

• 反应液（Reagent C）、稳定液（Reagent D）和反应工作液，避免光照

• 操作时注意安全，尤其在使用反应液（Reagent C）、稳定液（Reagent D）和反应工作液时，十分小心

• 待测样品无需纯化，包括去蛋白、去RNA等处理

• 计算实际浓度时，不要忘记待测样品的稀释倍数

• 使用无水乙醇清洗比色皿

• 本公司提供系列DNA定量分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定

• 本产品经鉴定定量准确