温度依赖的hERG 通道药理学与动力学特性（一）

简介

hERG (human ether-a go-go-related gene) 基因编码的延迟整流钾通道在哺乳动物和人的心肌细胞动作电位的控制中起着至关重要的作用。多种类型的化学治疗药物存在潜在的hERG 通道阻断风险，可能引起心电图上QT间期的延长。这可能导致严重的致死性室性心律失常——尖端扭转型室性心动过速（torsade de pointes, TdP）。TdP 风险是管理机构和制药公司从市场将药物撤出的主要原因之一（Trudeau, M. C. 1995, Sanguinetti M. C.1995）。

膜片钳技术是体外化合物hERG 抑制效应评价的金标准。尽管在技术层面难度增加，但接近生理温度条件下的膜片钳记录相比于室温条件下更适合于药物安全性评价实验，原因在于温度依赖性进程变化对稳态hERG 通道的抑制有重要影响。已发表数据表明，温度增加能加速hERG 的激活、失活、失活后恢复和去激活的动力学变化，以及稳态水平的抑制(Zhou, Z.1998)。其它研究也证明了一些化合物表现出明显的温度敏感性以及生理温度下显著的效能曲线移动(Sale, H. 2008, Kirsch, G. E, 2004)。因此在生理温度条件下开展功能性hERG筛选是有必要的。相比于传统手动膜片钳，全自动膜片钳系统实现更高的通量、耗费更少的人力资源，在早期功能性hERG 筛选方面开展更多工作。然而，第一代进入市场的全自动膜片钳系统只能进行室温条件下的筛选。

为满足这样的需求，IonFlux 系统配置温度控制模块，使得用户可以运行温度依赖性的电生理筛选。在本片文章中，我们展示了hERG 通道的药理学和动力学特性，比较了IonFlux 平台记录的室温条件与生理温度条件的结果。

材料和方法

监控温度平衡

温度改变可以通过细胞添加前孔电阻变化的测量进行监控。缓冲液的电导是温度依赖性的且随着温度的升高而增加。图2 显示了孔电阻测量结果可以直接作为监控温度平衡的替代性参数。IonFlux 系统可以实现从环境温度至40°C 的变化。在一分钟内达到5°C 的温度改变，一旦达到平衡后温度将持续保持稳定。

细胞准备

表达了hERG1a 的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞在37°C 和5% CO2 条件下培养在175cm2 顶部过滤的培养瓶中，培养基中含有DMEM、Glutamax-1 (Invitrogen，10565), 10%胎牛血清、和G-418 (500μg/ml)。细胞密度保持在90%以下，实验前转移至30°C 培养箱过夜孵育。细胞收集时，培养瓶先用2ml 的不含钙离子和镁离子的PBS 冲洗，然后加入5ml的Detachin.溶液处理2~5 分钟。在细胞重悬转移至外液中之前，1000rpm 离心90 秒。

溶液和化合物

细胞外液成分（ECS）含有（mM）：NaCl 140, KCl 2, MgCl2 3, CaCl2 1, HEPES 10, 葡萄糖9，用NaOH调pH至7.4 。细胞内液成分（ICS）含有（mM）：KCl 120, MgCl₂ 5，CaCl₂ 10, EGTA 5, Tris-ATP 4,HEPES 10,，用KOH调pH至7.3。重悬在细胞外液中的细胞被加入至IonFlux（每毫升5x10⁶个细胞）记录板。本研究中采用的hERG 电压刺激方案开始于+40mV并持续1秒，随后在–50mV水平下持续1.5秒，每10秒重复一次此方案。细胞钳制在-80mV。峰值尾电流在-50 mV时被记录。