温度依赖的hERG 通道药理学与动力学特性（二）

结果

温度依赖 的药理学特性

红霉素（ERM）在生理温度条件下具有显著的效能增强特点。图3A显示了室温条件下和生理温度条件下ERM对hERG抑制效应的时间--—电流点图。此实验中细胞在室温（22°C）条件下被捕获和封接，以及记录ERM的阻断。直至添加了300µM ERM 后才观察到显著的抑制效应。此抑制在冲洗后是可逆的。加热功能在冲洗时开启，温度设置在35°C。当温度和电流稳定后，重复添加不同浓度的ERM。使用IonFlux软件中原始电流图重叠功能，使得同一个集合细胞（20个细胞）记录的22°C与35°C电流图共同展现在图3B中。与室温条件相比，35°C 条件下记录的在快速衰减阶段的电流峰值几乎增加了一倍。在22°C时1000µM的ERM抑制了大约50% hERG 尾电流（图3C），而在35°C时同样浓度的ERM抑制了大约95%的hERG尾电流（图3D）此数值与文献报道的结果完全一致（Kirsch, G.E, 2004, Stanat, S, 2003）。

氟西汀是hERG的抑制剂，其不具体有温度依赖的效能改变。在另一个实验中，氟西汀作为对照品与其它两个化合物——红霉素和D,L索他洛尔在同一块记录板中进行检测（IF-HT，384孔）。氟西汀25°C和35°C条件下的剂量曲线叠加显示在图4A中。两个量效曲线大部分重叠在一起，IC50值分别是25°C时的3.8µM和35°C时的5.1µM。相反的，红霉素的量效曲线35°C条件下左移了超过3倍，从831µM(25°C)至251µM (35°C)，见图4B。D,L索他洛尔同样表现出显著的效能转移，从681µM(25°C)至215µM(35°C)，见图4C。结果表明氟西汀的hERG抑制效应对温度不敏感，而红霉素和索他洛尔是温度敏感的hERG阻断剂。这些结果与文献报道的一些明显温度依赖性化合物的结果一致(Kirsch,G.E,2004,Stanat,S,2003,Rajamani,S,2006,Thomas,D,2002)。

温度依赖的动力学特性

动力学转换的检测提供更多关于温度对离子通道电流影响的信息。我们研究比较了室温和生理温度条件下的hERG 原始电流图（图5）。首先，相比于22°C，35°C 条件下同一个集合细胞记录的电流幅度几乎超过两倍。其次，去激活阶段记录的外向尾电流在35°C 时同样表现出更快的衰减速度。单指数方程计算出的时间常数下降分别是22°C 时的938±16ms 和35°C 时的443±3ms。尽管时间常数的绝对值取决于激活的电压刺激方案，但其分数变化程度（即与室温相比相差大约2~3 倍）与文献报道是一致的（Zhou, Z. 1998）。

讨论

使用 IonFlux 温度控制模块，观察到红霉素与D,L 索他洛尔的抑制效应对温度是敏感的。在近生理温度条件下获得的检测结果IC50 值比室温条件下更低，但对于作为阴性对照的氟西汀，温度变换并没有表现出显著的效应改变。通过IonFlux 平台记录观察到的药理学效应漂移与手动膜片钳数据是一致的（表1）。

动力学研究表明hERG 尾电流峰值在生理温度条件下几乎增加两倍，且去激活引起的外向尾电流的衰减速度加快了2~3 倍，此结果同样与手动膜片钳数据是一致的。生理温度条件下的hERG 筛选产生的数据可以与在体的心脏安全评价数据提供更好的相关性。因而，在药物安全性评价实验中温度是一个值得关注的因素。IonFlux 系统独到的设计可以提供温度控制模块，便于开展温度可能最为重要因素的hERG 安全性筛选和其它温度依赖的离子通道靶标。

 

 

参考文献：

Trudeau, M.C & Robertson G.A. (1995) Science 269, 92-95

Sanguinetti MC et al. (1995). Cell 81:299-307

Zhou Z, et al. (1998) Biophys J 74:230-41

Sale, H. & Robertson G. A. (2008) Circ. Res. 108 185249

Kirsch, G. E. (2004) J . Pharm. & Tox. Methods 50, 93-101

Stanat, S. (2003) Molecular &. Cellular Biochem. 254, 1-7

Rajamani, S.(2006) British J. of Pharm. 149, 481-489

Thomas, D.(2002) J. of Pharm. &Exp. Therapeutics 300, 543-548