2 qPCR与dPCR比较研究
qPCR是目前DNA定量研究的主要技术，该技术通过在PCR反应体系中加入荧光结合染料(SYBR
green I) 或荧光标记的探针( 如TaqMan Probes)
，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，以此来评估PCR的扩增效果。qPCR主要依赖于校准物制备的标准曲线，进而确定未知样品的浓度，因此是一种相对定量的方法。该技术存在以下问题：a、校准品和样品间背景的不同将引入偏差，并且影响PCR的效率和测量响应；b、低拷贝数的目标
DNA分子不能通过扩增检测到；c、样品的PCR扩增效率可能与校准物的扩增效率不同；d、DNA提取时引入DNA溶液的杂质或者DNA降解影响了PCR动态扩增过程。
dPCR是一项检测和定量核酸的新技术。它不同于传统的qPCR，因为采用直接计数目标分子数而不依靠任何校准物或外标，dPCR通过计数单个分子从而实现绝对定量。dPCR将传统PCR的指数数据转换成数字信号，仅仅通过显示程序设定的循环数后扩增是否发生，即可克服上述困难，达到核酸的绝对定量。dPCR在进行扩增反应前，将含有DNA模板的PCR溶液稀释后分布到大量的独立反应室(图2) ，单分子间通过稀释分离，并且独自进行PCR扩增，最后分析每个扩增产物。这实现了通过先于PCR扩增的样品分离。这种样品的分配可以消除本底信号的影响，提高低 丰度靶标的扩增灵敏度，简单计算出DNA的模板拷贝数而不需要采用参考标准物或者外标。准确的定量依赖于40～45个循环的扩增，错误的阴性检出水平(单DNA模板出现在反应室而未被检出) 非常低。数字PCR是一项具有可重复性的定量微量DNA分子的优良技术。其操作方便、检测通量高、特异性强、灵敏度高、定量准确等优点使其成为了分子生物学研究中的重要工具。
图2 dPCR扩增反应原理
3 dPCR应用研究
3.1 dPCR在临床诊断方面的研究
dPCR应用于癌症的等位基因突变和拷贝数变异等方面的检测研究，为癌症检测提供了新的诊断工具。Oehler
等对慢性白血病的相关基因ABL酪氨酸激酶结构域突变采用了dPCR进行绝对定量检测，并且建立了同时检测多个ABL酪氨酸激酶结构域突变的方法。表皮生长因子受体(
epithelial growth factor receptor ，EGFR) 突变或过表达一般会引发肿瘤。Yung
等开发了一种关于非小细胞性肺癌患者血浆和肿瘤中的两种EGFR突变体( 第19外显子内缺失和第21外显子L858R 突变)
的dPCR定量检测方法。第19外显子内缺失和第21外显子L858R突变占酪氨酸激酶突变响应的85%
以上。实验结果表明这两种突变在预治疗的35个血浆样品分别检出6个(17%)和9个(26%)。与肿瘤细胞的测序结果相比，血浆EGFR突变的灵敏度和特异性是92%
和100%。在肿瘤和血浆中的低丰度EGFR突变通过微流体dPCR灵敏检测和精确定量将应用于预测治疗反应、监控疾病进展和早期检测获得性耐药等方面研究。
高通量基因分型验证与疾病相关的SNPs研究促使研究者采用一项新的技术，dPCR，对外周血液及口腔洗液提取DNA的基因分型进行评价分析。利用基于BioMark
PCR平台的Fluidigm
48×48动态阵列生物芯片进行SNP基因分型。共90个样品与20个SNP的体系对比，分别得到平均99.7%以及16个体系100%
的结果。TaqMan 基因分型与三组SNP进行对比得到了100%的相关性。为了研究DNA模板变化的影响，血液样品(
CH-1，n=20；CH-2，n=47；KK，n=47)和口腔洗液( n=37) 通过24个SNPs 进行基因分型。CH-1 和CH-2
批次显示了很好的基本响应(≥98.8%)，KK批次和口腔洗液样品响应较低(82.1% 和94.0
%)。但经再纯化后的KK和口腔洗液样品结果响应率有显著提高( 逸98.8% ).研究结果表明dPCR的准确度与TaqMan
基因分型类似，但DNA用量更少，节省了更多的人力、时间及成本。
拷贝数变异(copy number variation，CNV)
是人类遗传变异的重要来源，并且与大量的人类疾病密切相关。Qin等采用dPCR
系统精确定量了DNA样品的拷贝数，建立了dPCR的分析模型，并且进行了以下3个方面的研究：a、在一系列人类基因组和合成的RPP30基因中定量了RPP30基因的拷贝数，与预期结果相符；b、研究了商品化样品中的CYP2D6基因拷贝数，与传统手段定义的拷贝数一致；c、通过对ERBB2 基因的扩增筛选到了40个乳腺癌样品，与文献报道的基本一致。这项研究表明，dPCR为特异性CNV 的研究供了一个新的、精确的和强有力的技术支持。
孕妇血浆中的胎儿游离核酸(DNA和RNA检测开启了无创产前诊断的新领域，补充了唐氏综合症(非侵入性染色体异倍体) 产前诊方法。基于胎儿核酸的精确dPCR方法推进了此研究领域的发展，为孕妇及胎儿提供更安全诊断。在2007年，Lo等在证明了dPCR 可用于孕妇血浆RNA- SNP等位基因比率的测量后，应用该方法从整倍体胎盘DNA 样品中鉴别出21个三倍体样品。Lo等进一步证明：即使三倍体DNA以小量片段存在时，异倍体也能被检测到。后者对于针对母亲血浆建立的三倍体检测方式是十分必要的。Fan和Quake后续发表的文献也支持了这个观点。随后，Lo等针对以蛋白质- RNA 复合物方式存在于血浆中的胎儿游离RNA进行了研究。比较了质谱和dPCR对孕妇血浆中PLAC4基因的mRNA-SNP比率，其中质谱的临床灵敏度为90%，临床特异性为96.5%，dPCR的临床灵敏度和特异性均为100%。近期研究表明，与质谱检测和qPCR相比，dPCR可以获得更精确的定量结果。故此，dPCR检测胎儿DNA的浓度可能要高于预期。微流体芯片dPCR的快速发展，已成为目前临床应用最具潜力的无创产前诊断技术，并为其在常规检查中的应用奠定了基础。
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