摘要 数字PCR是一项针对单分子目标DNA的绝对定量技术。该技术是将含有DNA模板的反应溶液分配到大量独立的反应室中并且发生扩增反应，通过统计反应室中的阳性信号来定量DNA的拷贝数。DNA样品在反应室中随机和独立分布是单分子成功扩增和准确定量D
NA拷贝数的关键因素。本文综述了数字PCR的发展历史、数字PCR与实时荧光定量P
CR的区别，以及数字PCR在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面的最新进展，并展望了该技术的应用前景
关键词 数字PCR，绝对定量，实时荧光定量PCR，拷贝数，单分子。
核酸的序列、多样性和丰度分析是现代生物学的基础。核酸定量技术在诊断和个体化医疗、食品检验和转基因生物检测、病原体鉴定、法医科学等方面已被广泛应用，同时这些应用也推动了核酸定量技术的进步。
DNA分子扩增技术的应用促进了分子生物学技术的发展[2]。精确定量 DNA
拷贝数是现代分子生物学和医学的重要应用之一。数字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)作为
DNA 定量的新技术，克服了实时荧光定量PCR (real timequantitative PCR，qPCR)的一系列缺点，实现了单分子
DNA 绝对定量。dPCR是将单个 DNA 样品反应液分别进行数以百计的反应，并且每个反应分别进行扩增检测。dPCR是 DNA
绝对定量方法，解决了qPCR 所用的标准曲线对测量结果产生影响等问题，并可减少 qPCR
带来的基体效应。此技术在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面的研究发挥了重要作用。
1 dPCR技术发展历史
1992年，Sykes
等报道了基于样品稀释和泊松分布数据处理的巢式PCR定量技术，并提出了数字PCR的构想。1997年，Kalinina
等使用玻璃毛细管进行了微升(μl) 级的PCR反应，通过荧光探针收集到基因组DNA的单分子信号，进而发展了单分子定量技术。1999年,
Vogelstein 和Kinzler基于以上报道采用96孔板系统发展了微升级的PCR扩增方法，用于结肠癌的致癌突变基因ras
的定量分析。随之，Dressman 等发明了一种BEAMing方法(
珠子、乳剂、扩增与磁力)：将链霉亲和素与磁珠共价结合，磁珠外包裹一层生物素的PCR引物，进行扩增反应。反乳化作用后，使用流式细胞仪通过磁珠分析等位基因变异。尽管步骤较多，该技术仍不失为广泛应用于实验室定量DNA的理想方法，可以用来检测和定量单核苷酸多态性(single
nucleotide polymorphism，SNP)
或突变等核酸序列变异及含有变异等位基因的磁珠能够被流体分离排序，因而可应用于样品测序等序列分析。
尽管dPCR技术具备广阔应用前景，但由于96孔或384 孔平板加样的复杂操作为精确测量带来了困难，也难以解决高通量测量问题。微流体的出现和纳升(nl) 反应仪器的开发克服了这些技术的瓶颈。在2003年，Liu等使用微流体的概念，在微流体芯片上进行了400 个独立的3nl PCR反应。2008 年，嵌入式芯片的PCR 反应次数达到了9180 个6nl 的PCR平行反应。例如，Fluidigm公司的Biomark 系统，此系统微流体dPCR芯片由12个独立的微流体面板(panel) 和相应进样孔组成(图1). 每个面板含有765 个6nl 的独立反应室(partition)。4.6μl反应液通过进样孔进入后被分配到765个反应室进行独立扩增。该技术在日趋完善的同时，单次的反应数和检测精度成为此项技术研究的重点。最近，Heyries 等报道了一个百万级的微流体dPCR装置，成为了dPCR技术的又一重大突破。该装置通过表面张力以达到样品分布和疏水控制，提高了单分子DNA扩增的保真性，每皮升( pl) 进行100万个反应，达到每平方厘米(cm2) 44万个反应。这种装置可实现每10万个野生型序列中低于一个变异拷贝的检测。
图1 微流体dPCR的12×765 反应芯片
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