目的基因克隆包括保存用全长基因(gene for saving, GS)和表达用全长基因(gene for expression, GE)两部分。
这两部分所克隆的基因都是全长片段,但克隆的策略及目的不同。直接用精确克隆(及引物从基因CDS两端开始)很难找到高效价的引物,且cDNA中目的基因很少,成功克隆出基因很困难。因此我们选择在CDS两端设计高效价引物,先将基因从cDNA文库中克隆,将克隆插入T载体中。之后再设计一对用于精确克隆的引物,以插入目的基因的重组T载体为模板,克隆出用于表达的基因,插入T载体。GS目的基因的拷贝数很高,及时引物效价不高,仍然能获得GE。
全长基因难以获得时(如GC含量较高),可克隆目的基因中800~1000bp的片段用于表达。
1. 细胞复苏及培养
a. 确定细胞复苏用得培养液。培养液使用前37C水浴温育。
b. 预先准备10ml的相应培养液,用于洗涤复苏细胞
c. 从液氮中取出cell后,37C温育至融化。开盖前用酒精消毒
d. 用移液管将复苏细胞转入step b中的培养液中洗涤,除去冻存cell中的DMSO
e. 1000rpm,5min,去上清,轻轻振荡重悬cell,加入1ml左右新培养液,混匀
f. 转移cell至含20ml左右培养液的培养瓶中,盖口不能拧紧,37C培养至培养瓶壁贴满cell
g. 培养约2-3天至细胞贴满培养瓶壁时将细胞传代,分装两个培养瓶,一个保种,一个抽RNA。
2. RNA抽提
悬浮细胞 组织器官 单层贴壁细胞
(5-10X106) (50-100mg) 107
1000rpm,5min离心 匀浆 胰酶消化至细胞悬浮,1000rpm,5min离心
PBS洗涤两次(PBS无须DEPC处理),
1mlTRI REAGENT 裂解,用枪吹打混匀,室温5min
可-20度保存留用,or
200ul 氯仿(剧烈摇匀vortex,室温5min,ice 5 min)
12000g 15min 4℃
取水相(500ul以上)加入等体积异丙醇(室温5min,ice 5min)
加完异丙醇立即上下颠倒5-10次混匀,若同时抽多管,则每次加完一管后都应立即混匀
12000g 15min 4℃
倾倒除去上清,并用枪吸干
1ml 75%乙醇 wash一次,用枪吹打均匀
7500g, 5 min 4℃
去上清,尽量用枪吸尽
air dry the RNA pellet ,2~3min
do not let RNA turn translucent
50 ul ddH2O (DEPC treated) dissolve by a pipet
检测O.D值/1% agsrose 电泳
RNA分装成10ul后冻存,防止反复冻融使RNA降解。取RNA时一定带上手套,避免手上的RNA酶污染。
抽提RNA后应跑核酸电泳检测RNA纯度及降解程度。一般RNA抽提后应在700bp~1.5kb范围内有两条清晰的带。
3. Reverse Transcription
System(40ul)
5X buffer 8ul
0.1M DTT 4ul
dNTPs(10mM) 8ul
RNAse inhibitor 0.5ul
Superscriptase 1ul
Oligo(dT)12-16 (0.5ug/ul) 1 ul
Sample RNA (4ug) 4ug
DEPC H2O add to 40ul
将Oligo
dT与RNA,DEPC水混匀后,70C水浴10min(封口),冰浴2-3min,加入其余上述混合液,37C水浴1.5h,95C水浴5min(封口),冰浴,-20C
store。RT-PCR水浴时封口膜封EP管,防止水蒸发影响反应体系。
RT-PCR后用持家基因HPRT引物PCR,检测RNA抽提质量。HPRT退火温度60C左右。HPRT长度较小,为与引物二聚体区别,PCR时需做一不加模板的空白对照