若有非特异性条带，可进行Touchdown PCR，提高引物的特异性。
PCR反应条件：
1 94C 5min
2 94C 45s
3 65C 45s 退火温度视不同引物而定，此处65C仅作例证
4 72C 1min go to step 2; 30 cycle
5 72C 7min
6 4C x min 该步视情况而定，若PCR过夜则x=12h
step4的1min视基因长度而定，Taq DNA polymerase合成效率为2kb/min。
Taq PCR摸索好退火温度和延伸时间等后进行Pfu PCR。Pfu DNA合成效率比Taq酶（2000bp/min）低，因此Pfu
PCR的延伸时间比Taq PCR适当延长20s。
电泳验证后进行Pfu PCR
System(30µl):
10*reaction buffer(for Pfu enzyme) 3µl
dNTP 1.2µl
primers As 0.6µl
Sp 0.6µl
cDNA 0.5µl
ddH2O 23.3µl
Pfu 0.3
做四个30µl体系，以便进行胶回收。
关于PCR更多的问题可以参照附件中有关PCR的综述。
6． 胶回收（使用前检查kit里的Washing buffer是否已加无水乙醇，预开55－65度水浴）
采用上海申能博彩生物技术有限公司的DNA凝胶回收试剂盒，操作步骤如下：
A 紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶,计算凝胶重量。
B 每100mg胶加400ul的SN solution,于55-65C加热，间断混合，直至凝胶块完全熔化（约6-8min）。
C 每400ul的SN solution加入100ul的solutionB，混匀。
D 把混合液加入3S柱（DNA收集柱），室温放置2分钟后，10000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的液体。
E 向3S柱中加入600ul Wash solution, 10000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的液体。
F 重复e step
G 10000rpm离心2分钟，尽量取出液体，倒掉收集管中的液体。
H 将3S柱置于干净的1.5ml的EP管中，在3S柱的膜中央加入30ul预热的TE solution,
55-65。C水浴放置2分钟（可在水浴锅中加盖放置，提高洗脱效率），15000rpm离心1分钟。－20。C保存。为了提高洗脱的效率，可先用20ul洗脱，然后再重复用10－20ulTE洗脱。洗脱步骤相同。
胶回收时尽量用较少的TE洗脱(15ul)，提高胶回收产物的浓度。或DNA电泳时上样量增加也可获得相同效果。
PS：胶回收产物与载体连接时，决定连接效率的主要是胶回收产物的浓度。载体的含量可相对降低
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