取DEPC水时切记带上手套
Genequant使用方法:
开机-set-up-enter(只更改DNA/RNA,看光波是否为320nm)-set-ref(此时插入空白对照)-样品
1.使用前将比色皿中水吸出,用1ml蒸馏水重新洗涤再将比色皿中的水吸尽(先用1ml枪吸,后用100ul枪吸)。
2.加80ul水测对照
3.2ul RNA稀释40倍测浓度
4.测完后看RNA浓度(conc键),ratio值(ratio键)
4. 引物设计
利用VectorSuite NTI设计目的基因引物(克隆产物用于保存时,引物不用加酶切位点;用于表达蛋白时,引物两端须加上相应的酶切位点)
引物设计注意事项:
a. 所设计引物的rating值最好为171,两个引物的Tm值不能相差太大,最好在1C之内。Tm值应在50-70C之间,不能太小。
b. 设计好后,用NTI选择引物二聚体较少的primer,dimer最多不能超过8对。
c. 将NTI软件中的所有酶切位点全部加入。系统默认的酶切位点很少。
d. 目的基因片断中不能包含引物两端的酶切位点。
e. 酶切位点两端应加对应的保护碱基。
f. 对照相应的载体核对阅读框是否正确。注意载体a,b,c亚型ORF的区别。
g. 选择普遍表达、实验室有相关cDNA的基因或基因亚型。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed
h. 当表达载体的tag在C端时要注意插入片段后对tag读码框的影响。如his tag,要防止它因为读码框改变而变成Pro或Thr。
i. 核对读码框,保证质粒插入片断后不影响其MCS后面的终止子ORF,使融合蛋白能够有效的终止。
j. 目的片断的GC含量不能超过70%,最好65%以下。高GC值片断PCR不易成功
k. 3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’最好以G或C 结尾,防止AT 的松散结合引起错配
每条引物合成2OD(1OD约为33µg)
引物稀释
每个引物稀释成10µmol/ml
所加水量=3.3*10e6/MW µl
5. PCR
PCR退火用不带酶切位点和保护碱基那一段引物的退火温度。该温度可以用Vecter
NTI查询。用梯度PCR仪进行不同退火温度条件摸索。一般变动范围为8C即可。
Taq PCR摸复性温度
System(30µl):
10*reaction buffer(for Taq enzyme) 3µl
MgCl2 1.8µl
dNTP 1.5µl
primers As 1µl
Sp 1µl
cDNA 0.5µl
ddH2O 21µl
Taq 0.2µl
体系中cDNA和primers的量可以根据实际情况进行调整。如:PCR不能拉出产物时可以增加cDNA量至1µl。