实验方法原理 Northwestern 筛选蛋白表达文库的方法是通过构建 IPTG 可诱导的融合蛋白表达文库（融合蛋白的 N 端由载体序列编码，C 端由克隆到载体的 cDNA 文库编码），进而诱导融合蛋白表达，并将蛋白质固定于硝酸纤维素滤膜上，以标记的 RNA 探针进行筛选，最终获取能与靶 RNA 分子特异性结合蛋白质的 cDNA。

实验材料 表达库宿主菌抗生素

试剂、试剂盒 SM 缓冲液IPTG封闭缓冲液漂洗缓冲液结合缓冲液洗脱缓冲液FicollPVPBSATorula yeast core RNA

仪器、耗材 NZY 培养基LB 培养基NZY 顶层琼脂NZY 平板硝酸纤维素膜RNA 探针

实验步骤

―、材料与设备

1. 表达库：多采用 λ 噬菌体载体构建表达库，可根据需要选取载体。可购买预先制备好的表达库（Stratagenc 公司，Clontech 公司等均有售），也可以自己制备载体库。如 λgt11、λZAP 或 λORF8 等载体的多克隆位点前有 lacZ 基因，使融合蛋白能被 TPTG 诱导表达。改进型载体如 λTriplEx 可以使三个读码框都得到翻译，保证了蛋白质的表达。此外，还可以将组蛋白与 β-半乳糖苷酶融合，以便釆用蓝-白斑筛选重组体；在 λTriplEx 载体中加入 E.coli ompA 基因的 5'-UTR 可以提高重组体的稳定性。

2. 宿主菌：宿主菌一定要与库载体相对应。如 E.coli XL I-blue 可用作 λTriplEx 载体和 λZAP 载体的宿主菌。XL I-blue 菌的附加体 F' 中含有 △M15 lacZ 和 lac Iq 基因：△M15 lacZ 基因的表达可以通过 α 互补对重组克隆进行蓝-白斑筛选；lacIq 基因编码 lac 抑制子，在诱导剂 TPTG 不存在时抑制 lacZ 启动子的转录。

3. NZY 培养基：5 g NaCl，2 g MgSO4·7H2O，5 g 酵母提取物，10 g NZ胺（酪蛋白的酶促水解产物），定容至 1 L，高压灭菌后保存。

4. LB 培养基：10 g 蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g NaCl，定容至 1 L，调 pH 7.4，高压灭菌后保存。

5. NZY 顶层琼脂：NZY 培养基中加 0.7% 琼脂糖，高压灭菌。

6. NZY 平板：在 1 L NZY 培养基中加 15 g 琼脂粉，高压灭菌后铺板（约 70 ml/150 mm 培养皿，约 30 ml/100 mm 培养皿）。

7. 抗生素：氨芐青霉素：50 μg/ml；四环素：12.5 μg/ml。

8. SM 缓冲液：5.8 g NaCl，2 g MgSO4·7H2O，50 ml 1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5），5 ml 2% 明胶，定容于 1 L，高压灭菌。

9. 0.5 mol/L IPTG，X-Gal（2.5 g X-Gal 溶解于 10 ml 二甲基甲酰胺中），20% 麦芽糖，均过滤除菌。

10. 硝酸纤维素膜（建议使用 supported nitnKdliilose，BA-S85，Schleicher&-Schuell 公司）。

11. 32P 标记的 RNA 探针：常规制备，以含 7 mol/L 尿素的丙烯酰胺胶垂直电泳对探针进行纯化，用 HSCB 缓冲液 [ 25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5 )，400 mmol/L NaCl，0.1% SDS ] 洗脱过夜。

12. 封闭缓冲液：5 mg/ml Torula yeast core RNA（Sigma 公司），10 mmol/L Tris- HCl（pH 7.8），150 mmol/L NaCl。

13. 漂洗缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.8 )。

14. 结合缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.8），1 mmol/L EDTA，0.02% Ficoll，0.02% 聚乙稀吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP），0.02% 牛血清白蛋白及预试验确定浓度的 NaCl（通常为 50 mmol/L 左右）。

15. 洗脱缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.8），1 mmol/L EDTA，0.02% Ficoll，0.02% PVP，0.02% 牛血清白蛋白及预试验确定浓度的 NaCl（通常为 100 mmol/L 左右）。

16. 2% Ficoll（10X 储存液）：2 g Ficoll ( type 400 ) 溶解于 100 ml 蒸馏水中，110℃ 灭菌 15 min，4℃ 可保存 1 个月。

17. 2% PVP（10X 储存液）：2 g PVP（分子质量为 40000 Da）溶解于 100 ml 蒸馏水中，110°C 灭菌 15 min，4°C 可保存 1 个月。

18. 2% BSA（10X 储存液）：2 g 高纯度的牛血清白蛋白溶解于 100 ml 蒸馏水中，过滤除菌，-20℃ 保存。

19. 50 mg/ml Torula yeast core RNA（10X 储存液）：5 g Torula yeast core RNA 溶解于 100 ml 蒸馏水中，蛋白酶 K（0.25 mg/ml）37℃ 处理 1 h，酚：氯仿抽提，乙醇沉淀以去除污染的核酸酶。

二、操作方法

1. λ 噬菌体库的保存与操作

购买获得的 λ 噬菌体文库大多保存在 7% DMSO 中，DMSO 对噬菌体的活性没有影响，因此不必去除即可直接进行操作。若要长期储存，应将其分装成 50 μl 小份，于 -80℃ 保存，避免反复冻融，若要对文库进行稀释，则需采用 SM 缓冲液；工作样品可以在 4℃ 保存 2 个月。

在进行实验前，最好对购买的文库进行滴度检测，好的 cDNA 文库应 ≥108 pfu/ml，并且应含有 ≥104 的不同克隆，以保证所表达蛋白质的多样性。此外，还要求至少含有 75% 的重组克隆。

2. 宿主菌制备

接种单克隆宿主菌至 50 ml 含有 10 mmol/L MgSO4、0.2% 麦芽糖（MgSO4 和麦芽糖可以帮助噬菌体进入宿主菌）的 LB 培养液中，30℃ 120 r/min 振摇培养过夜，至 OD600 达 2.0。较低的温度和通气量可以保证过夜培养不会生长过度。

2000 r/min 离心 5 min 收集菌体，去除上清，用 10 mmol/L MgSO4 溶液重悬，使 OD600 介于 0.5 至 1.0 之间。一定要避免使用涡旋振荡器，但又要保证细胞完全重悬。重悬的细菌可在 4℃ 保存 1 个星期，而不出现明显的活性降低。

3. 噬菌体表达库涂板

(1) 在 20 个反应管中分别加入 1 ml MgSO4 重悬的细菌悬液和适量的噬菌体文库（约 5X104 pfu），37℃ 孵育 15~20 min，使噬菌体进入宿主菌。

(2) 在每个反应管中逐次加入 9 ml 融化的 NZY 顶层琼脂，并立即涂布 150 mm NZY 平板（融化的 NZY 顶层琼脂应冷却至 45℃ 再使用；每个反应管需在加入 NZY 顶层琼脂后立即涂板；NZY 平板需在 37℃ 预热，加入 NZY 顶层琼脂后尽快转动平板以使细菌层 分布均匀；20 个反应管的筛选总数为约 106 噬菌斑）。室温放置 10 min 使顶层琼脂凝固，倒置平板于 37℃ 孵育 3~5 h 至微小的噬菌斑出现。在孵育过程中注意不要将平板叠放以保证每块板温度一致，使噬菌斑同时出现。

4. IPTG 诱导蛋白表达及蛋白的转膜

(1) 用圆珠笔在硝酸纤维素滤膜上不与平板接触面进行标号。在孵育平板的过程中，将膜浸入 10 mmol/L IPTG 中 30 min，再放在 3 MM 滤纸上吸干 5 min，确保膜在铺到平板上时处于微湿状态。在操作中需戴手套，并使用灭菌的镊子。

(2) 将用 IPTG 预处理过的膜铺在长出噬菌斑的平板上，37°C 孵育 4 h 诱导重组蛋白的表达。

(3) 对膜和平板做好标记后（可以用大头针在不同的位置进行标记）小心取下膜，注意不要带下顶层琼脂，可以在取膜前先将平板和膜在冰箱内放置 15 min 后再取膜。将取下的膜放在 3 MM 滤纸上吸干 5 min 后浸入封闭缓冲液，平板保存于 4℃ 备用。

5. RNA 探针制备

(1) 用 T7/T3/SP6 RNA 聚合酶体外转录制备探针。通常使用 [ α-32P ] UTP 进行标记，合成的 RNA 中近 1/10 的尿嘧啶核苷酸标记了同位素。

(2) 转录后，用酚对 RNA 进行抽提，再用 50% 的含 7 mol/L 尿素的丙烯酰胺凝胶垂直电泳对探针进行纯化。放射自显影确定探针位置，切胶回收，用 HSCB 缓冲液过夜洗脱得到 RNA 探针，用酚：氯仿进行抽提并进行定量。

6. 探针与膜的共孵育

(1) 结合有噬菌体蛋白的硝酸纤维膜在封闭缓冲液中进行预杂交，37℃ 摇床孵育 1 h ( 40~50 r/min ) 封闭非特异结合位点。封闭缓冲液和杂交缓冲液均十分黏稠，操作中不仅要避免起泡，还要尽量保证与膜作用的均一。操作中所用的容器和器具都应预先处理， 避免核酸酶污染。

(2) 用 500 ml 漂洗缓冲液洗膜两次，立即转入 100 ml 加有探针 RNA 的结合缓冲液中。于室温在摇床 ( 40~50 r/min ) 上孵育 1 h。

7. 洗膜

用 250 ml 洗脱缓冲液洗膜，重复数次直至放射性本底水平降至最低。可用对应于未经噬菌体转染的细菌板的蛋白交联膜作为阴性对照。

8. 放射自显影挑取阳性克隆

将膜放在 3 MM 滤纸吸干，用保鲜膜包裹，-70℃ 放射自显影。曝光时间取决于探针的浓度和信号的强度（对于 107 cpm/ml 的探针，曝光 8~16 h 就可以观察到阳性结果）。此外，可以在蛋白转膜过程中重复一次转膜操作，得到两张对应同一块培养板的膜， 进行杂交反应。

将定影后的 X 射线片与膜、培养板进行对照，找出阳性点对应在平板上的噬菌斑的位置。从板上挑取阳性噬菌斑，分别加入 1 ml SM 缓冲液和 2 滴氯仿洗脱获取噬菌体。

9. 阳性克隆的确证

为证实所获阳性克隆的可靠性，需要进行二次筛选。从平板上过夜洗脱得到的噬菌体颗粒重新铺板，密度约为 100 mm NZY 琼脂平板有 200 个克隆，操作同前。第二次筛选的硝酸纤维素膜上的阳性克隆数应该增多，挑取单个的阳性克隆。如果需要，还可以进行第三轮筛选，这次每块平板约铺 50 个克隆。